臨沂地區(qū)高毒力肺炎克雷伯菌的分子特征分析

(山東醫(yī)專附屬醫(yī)院，山東 臨沂 276000)

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae，KP)是臨床上常見的致病菌，可引起各種感染，根據(jù)莢膜多糖抗原可分為79個(gè)血清型，根據(jù)致病性的不同可分為普通KP(cKP)和高毒力KP(hvKP)。與cKP相比，hvKP除了具有高黏液表型，還攜帶多種毒力基因，具有更高的毒力，可導(dǎo)致多部位感染，如腦膜炎、眼內(nèi)炎及壞死性筋膜炎等，嚴(yán)重者可危及生命[1]。hvKP的莢膜型主要為K1、K2、K5、K16、K20、K54和K57型[2]。在由KP引起的感染中，hvKP所占的比例逐年升高，對(duì)抗生素的敏感性逐年降低，產(chǎn)ESBLs和KPC酶的hvKP陸續(xù)出現(xiàn)，hvKP在臨床感染中受到越來越多的重視。本研究將分析臨沂地區(qū)hvKP的黏液表型、莢膜分型、毒力基因攜帶情況，從而為hvKP的實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床防治提供有效的參考信息。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 2015年1月至2016年5月就診于臨沂市人民醫(yī)院69例患者標(biāo)本中培養(yǎng)分離的KP，患者臨床表現(xiàn)為具有某一器官或多器官感染。

1.2研究方法 對(duì)自患者標(biāo)本中分離出的69株KP進(jìn)行黏液絲試驗(yàn)(String test，ST)、莢膜分型、毒力基因檢測，尋找致病菌的分子生物學(xué)特征。

1.2.1ST試驗(yàn) 將KP接種于含5%羊血的瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，用接種環(huán)輕輕向上挑起菌落，如不能挑起黏液絲或黏液絲長度小于5 mm，則ST試驗(yàn)陰性，若黏液絲長度大于或等于5 mm，則ST試驗(yàn)陽性[3]。ST陽性菌落為高黏液型，菌株屬于高毒力株，即hvKP。

1.2.2莢膜分型及毒力基因的檢測 采用PCR擴(kuò)增法檢測，步驟如下：(1)DNA模板提?。禾羧?5 ℃培養(yǎng)16～18 h的KP菌落于400 μL去離子水的EP管中，置入100 ℃加熱儀中加熱15 min，12 000 g離心5 min，吸取上清液，提取DNA。(2)PCR反應(yīng)：K1、K2、K5、K54、K57、rmpA和aerobactin的引物序列和反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)[4]。引物由上海生工合成，Primix購自Takara公司，含擴(kuò)增所需緩沖液、dNTP、Taq酶及Mg2+。反應(yīng)體系為25 μL，Primix10 μL、模板3μL，10 μM的上下游引物各2 μL，水8 μL。(3)電泳及成像：使用100 V電壓、1%瓊脂糖凝膠對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠成像儀對(duì)電泳后的產(chǎn)物進(jìn)行成像。

2 結(jié)果

69株KP中具有高黏液表型的hvKP有37株，cKP32株。37株hvKP的莢膜分型及毒力基因攜帶情況見表1，PCR結(jié)果見圖1。32株cKP中，K1型占3.1%，K2型占12.5%；rmpA的攜帶率為9.4%，aerobactin的攜帶率為15.6%。

圖1 莢膜分型及毒力基因的電泳圖

表1 37株hvKP的分子生物學(xué)特性

3 討論

一直以來，hvKP的高侵襲力、高致病性是備受關(guān)注的問題。hvKP易侵入血流后引起其它部位的膿腫，如膿毒血癥、肺膿腫、全身中毒性休克綜合征、腦膿腫、眼內(nèi)炎及神經(jīng)炎等，最常見的是肝膿腫，部分感染者短時(shí)間內(nèi)不易治愈，有時(shí)反復(fù)發(fā)作，對(duì)病人的健康和生命安全造成很大的威脅。診斷hvKP的依據(jù)中，除了其生物學(xué)特性，臨床癥狀也是非常重要的鑒定指征，從致病性方面來看，肝膿腫是hvKP感染最常見的癥狀[5-7]。目前，鑒定hvKP的指標(biāo)還未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室診斷的特征是高粘液表型，但研究發(fā)現(xiàn)并不是所有的hvKP都是高粘液表型[8-10]。為此，對(duì)該病的防治需要進(jìn)一步尋求鑒定指征。

血清型K1和K2的莢膜一直以來被認(rèn)為是重要毒力因子。K1血清型在hvKP菌株的表達(dá)率約為47%～81%、K2約為20%[11-12]。因?yàn)閔vKP菌株引起的肝膿腫以K1或K2型居多，最初這些莢膜血清型被認(rèn)為是這種感染性綜合征的重要的毒力因子。本研究發(fā)現(xiàn)K1和K2是hvKP菌株常見的莢膜血清型，因此K1或K2型可以作為實(shí)驗(yàn)室的輔助指標(biāo)診斷hvKP。

高毒力株的高黏液表型與黏液表型調(diào)節(jié)基因rmpA相關(guān)，該基因可正向調(diào)控莢膜多糖的合成，使其產(chǎn)量增加，菌落表現(xiàn)為黏液型。Aerobactin是一種鐵載體，可與宿主的轉(zhuǎn)鐵蛋白競爭鐵離子，動(dòng)物模型顯示，aerobactin可使KP的毒力增強(qiáng)100倍，也與菌落的黏液性相關(guān)。這兩種基因常存在于hvKP中，許多研究表明hvKP菌株毒力水平高是由于莢膜表達(dá)增加(高粘液表型)和同時(shí)伴隨鐵的獲取能力增加及其它尚未明確的因素。本研究數(shù)據(jù)表明攜帶高毒力因素KP的rmpA、aerobactin基因的表達(dá)較高，這與文獻(xiàn)研究一致。本研究中收集的hvKP全部表達(dá)aerobactin基因或rmpA，因此rmpA或aerobactin基因可以作為實(shí)驗(yàn)室診斷hvKP的輔助參考指標(biāo)。