烤煙根系分泌物自毒效應(yīng)研究

譚小兵，朱 媛，楊煥文，王 戈*，白羽祥，呂世保，程亞東

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，云南 昆明 650201; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】烤煙是中國主要經(jīng)濟(jì)作物之一，屬于茄科(Solanaceae)忌連作作物，但由于可用耕地面積有限和生態(tài)條件等因素，導(dǎo)致連作現(xiàn)象普遍存在。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國烤煙連作面積占烤煙總種植面積的30 %～60 %，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[1]。長(zhǎng)時(shí)間連作會(huì)造成土壤有毒物質(zhì)積累，理化性狀惡化，同時(shí)微生物結(jié)構(gòu)失衡，且煙葉產(chǎn)質(zhì)量降低，病蟲害發(fā)生率顯著增加[2-4]，嚴(yán)重制約了中國煙葉生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自毒作用(autotoxicity)是植物根分泌和殘茬降解時(shí)釋放出的次生代謝物對(duì)其自身或種內(nèi)植物產(chǎn)生危害的一種現(xiàn)象[5]，許多作物連作障礙與此密切相關(guān)[6]。目前，國內(nèi)外已有不少有關(guān)根系分泌物與連作障礙關(guān)系的研究報(bào)道。相關(guān)研究表明，根系分泌物會(huì)顯著抑制烤煙幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育及其生理代謝過程[7-9]。【本研究切入點(diǎn)】至今有關(guān)烤煙根系分泌物與烤煙產(chǎn)生連作障礙方面的研究甚少，更沒有對(duì)根系分泌物自毒物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定?！緮M解決問題】本試驗(yàn)在水培條件下提取烤煙根系分泌物，通過外源添加模擬連作條件，研究根系分泌物對(duì)自身種子萌發(fā)和幼苗生理指標(biāo)的影響，旨在探討烤煙根系分泌物對(duì)連作障礙的影響，為豐富烤煙連作障礙機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為烤煙主栽品種紅花大金元(以下簡(jiǎn)稱紅大)，供試種子為裸種，由南方育種中心提供，將紅大種子用2 %的硫酸銅消毒15 min，催芽后播于育苗盤上，采用常規(guī)烤煙漂浮育苗。

1.2 根系分泌物收集

根系分泌物收集在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)樓完成。采用水培法收集，具體步驟為：紅大幼苗(4葉1心)時(shí)進(jìn)行營養(yǎng)培養(yǎng)試驗(yàn)，營養(yǎng)液采用Hogland營養(yǎng)液和Amon微量元素營養(yǎng)液，培養(yǎng)液以淹沒根部為度，每天加去離子水至規(guī)定刻度，定時(shí)通氧；每3 d測(cè)1次pH，調(diào)整pH至6.0±0.2，每周更換1次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液培養(yǎng)兩周后收集根系分泌物，將煙苗從營養(yǎng)液中取出，去離子水沖洗干凈后，將煙苗放入用錫箔紙包裹的盛有無菌去離子水的三角瓶中培養(yǎng)(原光條件下)，每天收集6 h(9:00-15:00)，連續(xù)收集5 d，合并收集液后制成濃度為1.00 g/mL(表示1 mL水溶液中含有1.0 g植物鮮重的根系分泌物)根系分泌物母液，加入幾滴5 mg/L百里酚溶液后密封置入-20 ℃低溫下冷藏備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將4葉1心煙苗移入塑料盆缽(9.5 cm×9.0 cm×11.5 cm)培養(yǎng)，基質(zhì)為煙草專用育苗基質(zhì)，每盆定植3株，向內(nèi)添加200 mL營養(yǎng)液(Ca(NO3)2·4H2O 1.18 g/L，KNO30.51 g/L，MgSO4·7 H2O 0.49 g/L，KH2PO40.14 g/L)，第5葉完全展開時(shí)一次性添加不同濃度根系分泌物水溶液50 mL，濃度梯度為0(CK)、0.25、0.50和1.00 g/mL，3次重復(fù)，每天每盆定量添加20 mL蒸餾水，培養(yǎng)20 d后采集幼苗葉片和根系測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定及方法 ①根系分泌物對(duì)種子萌發(fā)的影響:準(zhǔn)確吸取3個(gè)濃度的根系分泌物10 mL加入到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿整齊排入50粒紅大種子(裸種)，每處理3個(gè)重復(fù)，26 ℃下光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)14 d后調(diào)查發(fā)芽率。②根系分泌物對(duì)幼苗生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的影響。生物性狀及總?cè)~綠素測(cè)定：取樣后立即測(cè)量各處理株高和根長(zhǎng)，用吸水紙吸干后測(cè)量地上和地下部分鮮重。用日產(chǎn)SPAD-502測(cè)定煙苗葉片總?cè)~綠素含量的相對(duì)值。每個(gè)處理測(cè)定3株。根系活力、pH值及相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[10]測(cè)定紅大根系活力，pH值采用PHS-2C酸度計(jì)測(cè)定，用電導(dǎo)率儀(上海雷磁儀器廠)測(cè)定煙苗的相對(duì)電導(dǎo)率。氧化酶活性測(cè)定：SOD、POD和CAT活性測(cè)定參考李合生[10]的方法。SOD活性采用NBT-還原法，POD酶活性采用愈創(chuàng)木酚法，CAT以每分鐘減少0.01為一個(gè)酶活力單位(U/g·min FW)，通過測(cè)定OD532、OD600和OD450值，按公式C(μmol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450計(jì)算MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)紅大自身種子發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)的影響

從表1可見，紅大根系分泌物會(huì)顯著降低紅大種子發(fā)芽率和各項(xiàng)生物性狀指標(biāo)。隨著分泌物濃度的增加種子發(fā)芽率顯著降低，表現(xiàn)為1.00 g/mL<0.50 g/mL<0.25 g/mL

表1 不同處理對(duì)紅大種子發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)的影響

注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。表中同列不同小寫字母表示不同處理之間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: The data are means ± standard deviation,n=3. Different lowercases in the same column indicate significant difference in different treatments at 5 % level. The same as below.

2.2 不同處理對(duì)紅大幼苗生理特性的影響

2.2.1 對(duì)葉綠素總量(SPAD)的影響 隨根系分泌物濃度增加紅大幼苗總?cè)~綠素含量顯著降低(圖1)，濃度為0.50 g/mL和1.00 g/mL較CK幼苗葉綠素含量分別顯著降低了39.18 %和54.64 %；低濃度(0.25 g/mL)幼苗葉綠素含量較CK降低4.42 %，兩者差異未達(dá)到顯著水平。表明根系分泌物會(huì)抑制葉內(nèi)葉綠素合成，從而降低植株光合速率，進(jìn)而影響煙株物質(zhì)合成。

2.2.2 對(duì)根系活力的影響 從圖2可見，根系分泌物對(duì)紅大幼苗根系活力具有顯著的抑制作用，且各處理濃度間達(dá)到了顯著水平。幼苗根系活力隨著根系分泌物濃度的增加逐漸下降，表現(xiàn)為CK>0.25g/mL>0.50 g/mL>1.00 g/mL，其中在低濃度(0.25 g/mL)時(shí)根系活力237.81 μg/h,FW較CK 266.09 μg/h,FW顯著降低了10.63 %，降幅最??；高濃度(1.00 g/mL)時(shí)根系活力為75.59 μg/h,FW相比CK降幅最大為71.59 %。說明根系分泌物中自毒物質(zhì)嚴(yán)重抑制了根系的生長(zhǎng)發(fā)育。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。不同小寫字母表示不同濃度處理間差異顯著(P<0.05)，下同The date are means ± standard deviation of three replicates. Different small letters indicate significant different among treatments(P<0.05), the same as below圖1 不同處理對(duì)紅大幼苗總?cè)~綠素含量的影響Fig.1 Effect of different treatments on Chl content(SPAD)

圖2 不同處理對(duì)紅大幼苗根系活力的影響Fig.2 Effect of different treatments on root activity

2.2.3 對(duì)葉片和根際pH值的影響 不同的根系分泌物濃度對(duì)紅大幼苗葉片和根際pH影響顯著(圖3)。表現(xiàn)為隨著根際分泌物濃度的增加紅大根際pH逐漸降低。同時(shí)隨著分泌物濃度的增加幼苗葉片的pH值表現(xiàn)出先降低后上升的趨勢(shì)，在濃度為0.50 g/mL時(shí)達(dá)到最小，且3個(gè)濃度處理均顯著低于CK，分別較CK降低4.26 %、8.34 %、5.40 %。

2.2.4 對(duì)紅大葉片和根系電導(dǎo)率的影響從圖4可見，各處理之間葉片和根系導(dǎo)電率均表現(xiàn)為1.00 g/mL>0.50 g/mL>0.25 g/mL>CK。其中葉片相對(duì)電導(dǎo)率較CK分別提高4.24 %、6.59 %和8.69 %，根系相對(duì)導(dǎo)電率較CK分別提高8.11 %、16.33 %和19.23 %，且各處理之間差異顯著。表明烤煙根系分泌物中存在某些化學(xué)物質(zhì)使細(xì)胞膜透性受到破壞，濃度越高破壞程度越大。

2.3 不同處理對(duì)紅大幼苗保護(hù)酶活性和膜脂過氧化物的影響

2.3.1 對(duì)POD活性的影響 根系分泌物對(duì)紅大幼苗內(nèi)POD活性存在不同程度的影響(圖5)。葉片POD活性表現(xiàn)為1.00 g/mL>0.50 g/mL>0.25 g/mL>CK，呈現(xiàn)出隨著處理濃度的增加而增加的趨勢(shì)，其中高濃度(1.00 g/mL)較CK顯著提高57.04 %，且與0.50 g/mL與0.25 g/mL也達(dá)到顯著水平；幼苗根系POD活性隨根系分泌物濃度增加呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在0.5 g/mL時(shí)達(dá)到最大值，較CK提高35.71 %，同時(shí)低濃度(0.25 g/mL)和高濃度(1.00 g/mL)較CK也分別提高了19.55 %、7.30 %。說明根系分泌物會(huì)導(dǎo)致煙苗體內(nèi)活性氧水平增加，從而誘導(dǎo)POD活性的提高。

圖3 不同處理對(duì)紅大幼苗葉片和根際pH值的影響Fig.3 Effect of different treatments on pH value in leaves and rhizosphere

圖4 不同處理對(duì)紅大幼苗葉片和根系相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effect of different treatments on relative conductivity in leaves and root

圖5 不同處理對(duì)紅大幼苗葉片和根系POD活性的影響Fig.5 Effect of different treatments on POD activity in leaves and root

2.3.2 對(duì)紅大SOD活性的影響 從圖6可見，隨根系分泌物濃度增加幼苗葉片和根系SOD活性表現(xiàn)為先增后降的趨勢(shì)。幼苗根系SOD活性在0.25 g/mL時(shí)最高為144.83 U/g·min,FW，顯著高于其他處理，且在高濃度1.00 g/mL時(shí)活性最低為126.12 U/g·min,FW，顯著低于其他處理，與CK相比下降7.31 %。幼苗葉片SOD活性在0.50 g/mL是最高，表現(xiàn)為0.50 g/mL>1.00 g/mL>0.25 g/mL>CK，且各濃度處理SOD活性均顯著高于CK，進(jìn)一步證明根系分泌物會(huì)對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生破壞，誘導(dǎo)了SOD活性的升高。

2.3.3 對(duì)紅大CAT活性的影響 從圖7可見，隨著根系分泌物濃度的增加，紅大幼苗葉片和根系CAT活性呈先增加后降低的趨勢(shì)。2者均在作用濃度超過0.25 g/mL后開始下降，在1.00 g/mL達(dá)到最低。低濃度(0.25 g/mL)處理根系和葉片中CAT活性顯著高于其他處理，說明自毒物質(zhì)含量較低時(shí)誘導(dǎo)煙株體內(nèi)CAT活性增加以降低自毒物質(zhì)傷害；但隨處理作用濃度增加，根系和葉片中CAT活性顯著降低，其中高濃度(1.00 g/mL)處理與CK相比根系中CAT活性顯著下降24.85 %，葉片中CAT活性顯著下降7.55 %，說明隨著濃度的增加，烤煙幼苗對(duì)根系分泌物中的自毒物質(zhì)耐受力降低。

圖6 不同處理對(duì)紅大葉片和根系SOD活性的影響Fig.6 Effect of different treatments on SOD activity in leaves and root

圖7 不同處理對(duì)紅大幼苗葉片和根系CAT活性的影響Fig.7 Effect of different treatments on CAT activity in leaves and root of tobacco

2.3.4 對(duì)紅大MDA含量的影響 從圖8可見，隨著根系分泌物濃度增加紅大幼苗葉片和根系MDA含量逐漸升高。高濃度(1.00 g/mL)處理與CK相比葉片中MDA含量增加39.34 %，且顯著高于0.25和0.50 g/mL處理，同時(shí)高濃度(1.00 g/mL)處理與CK相比根系中MDA含量增加65.69 %，兩者差異顯著，且1.00與0.25 g/mL處理之間差異也達(dá)到顯著水平。說明根系分泌物導(dǎo)致膜脂過氧化程度加劇，膜系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷，植株抗逆性降低。

3 討 論

植物產(chǎn)生連作障礙是植物與土壤環(huán)境共同作用的結(jié)果。其中植物化感自毒作用是連作障礙發(fā)生的一個(gè)重要原因，而自毒作用主要依賴于植物根系分泌物質(zhì)到環(huán)境中抑制植物生長(zhǎng)[11]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，根系分泌物中的自毒物質(zhì)通過影響土壤理化性狀、土壤微生物結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜透性、抗氧化酶系統(tǒng)、營養(yǎng)狀況以及病蟲害發(fā)生率等多方面來抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育[12-13]。

圖8 不同處理對(duì)紅大葉片和根系MDA的影響Fig.8 Effect of different treatments on MDA content in leaves and root of tobacco

本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅大根系分泌物會(huì)顯著抑制紅大種子發(fā)芽率、株高、根長(zhǎng)、地上部分以及地下部分鮮重，表現(xiàn)在隨著根系分泌物濃度的增加抑制作用增加，在高濃度(1.00 g/mL)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這與前人研究結(jié)果一致[14]。表明了烤煙根系分泌物中存在抑制自身種子萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育的有毒物質(zhì)。同時(shí)這種抑制作用在根長(zhǎng)、地上以及地下部分鮮重上表現(xiàn)極為明顯，可能原因是根系是與自毒物質(zhì)直接接觸的器官，從而影響植株對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受阻。有研究表明根系較其他器官對(duì)自毒物質(zhì)的響應(yīng)更加敏感[15]。本研究結(jié)果中，根系分泌物會(huì)顯著降低幼苗總?cè)~綠素含量、根系活力以及煙株的pH。說明根系分泌物會(huì)導(dǎo)致煙株光合能力降低，破壞細(xì)胞膜通透性，加大離子滲透量以及使根系還原能力下降。相關(guān)研究結(jié)果表明，根系分泌物中有機(jī)酸以及酚酸類物質(zhì)會(huì)抑制煙株光合作用，降低葉綠素含量以及根系長(zhǎng)度[16-20]，這與本研究結(jié)果一致。SOD、POD和CAT活性是植株內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)于植株抗逆性系統(tǒng)穩(wěn)定性具有重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，根系分泌物會(huì)破壞幼苗體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)。表現(xiàn)為幼苗內(nèi)SOD、POD和CAT活性的增加以降低自毒物質(zhì)對(duì)煙苗抗氧化酶系統(tǒng)的破壞。除幼苗葉片POD活性隨著處理濃度增加而增加外，其他SOD、POD和CAT活性均隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著根系分泌物濃度增大，使得自毒物質(zhì)也隨之增加，導(dǎo)致幼苗體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)遭受破壞，抗逆性性降低，使得酶活性受到抑制，且不同的酶對(duì)這種毒害作用的耐受力不同，進(jìn)而導(dǎo)致各種酶活性降低時(shí)的根系分泌物作用濃度不同[12]。同時(shí)，根系分泌物也會(huì)導(dǎo)致煙苗體內(nèi)MDA含量增加。這也進(jìn)一步說明植株抗氧化酶系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞。相似的研究結(jié)果也有過報(bào)道[21-22]。

4 結(jié) 論

在烤煙根系分泌物中的確存在自毒物質(zhì)，并且會(huì)隨著此類物質(zhì)的濃度以及含量的變化而產(chǎn)生不同的自毒效應(yīng)。表現(xiàn)為種子發(fā)芽率、煙苗素質(zhì)、光合作用等受到抑制、抗氧化酶系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞，從而導(dǎo)致烤煙生理代謝受到破壞，進(jìn)而影響煙株生長(zhǎng)發(fā)育。這也可以在一定程度上解釋隨著烤煙連作年限的增加，土壤中有毒物質(zhì)不斷累積，導(dǎo)致烤煙產(chǎn)質(zhì)量大幅降低，病蟲害急劇增加等現(xiàn)象。為進(jìn)一步弄清烤煙連作障礙機(jī)理，還有必要對(duì)根系分泌物種類和含量進(jìn)行定性定量分析，以確定自毒物質(zhì)種類及致毒含量。