精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代下胸部腫瘤生物樣本庫規(guī)范化建設(shè)

邢 杰，余科科，張 葉，韓寶惠，徐 蕾

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們通過大量的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究對當(dāng)前疾病的認(rèn)識也越來越深入，然而研究結(jié)果越來越多，真正能夠轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用的卻并沒有明顯增多，其中一個(gè)重要的原因就是基礎(chǔ)研究和臨床研究之間沒有建立起一個(gè)很好的橋梁[1-3]。2011年，國家醫(yī)學(xué)科技發(fā)展十二五規(guī)劃明確將生物樣本資源庫作為“支撐醫(yī)學(xué)項(xiàng)目”重要工作之一，2015年，國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會批準(zhǔn)成立生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化委員會，在國家大力支持下，國內(nèi)的生物樣本庫取得了長足的發(fā)展[4-5]。

2016年，國家癌癥中心發(fā)布中國最新癌癥數(shù)據(jù)，其中肺癌的發(fā)病率和死亡率均居第一位，因此，與肺癌相關(guān)的精準(zhǔn)診斷、個(gè)體化治療的研究就顯得尤為重要。作為基礎(chǔ)和臨床研究基石的高質(zhì)量生物樣本則成為重中之重。2016年，上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院胸部腫瘤手術(shù)量已逾10 000臺，依托于豐富的臨床資源，我院建立了胸部腫瘤生物樣本庫，建設(shè)目標(biāo)是立足資源平臺建設(shè)，推動以肺癌為主的胸部腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究，進(jìn)而促進(jìn)多學(xué)科診治。

1 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代生物樣本庫發(fā)展

1.1 國外生物樣本庫建設(shè) 國外生物樣本庫起步較早，并且已經(jīng)形成了信息化和網(wǎng)絡(luò)化管理，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國外對人類生物樣本資源的保存和研究越來越重視，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了生物樣本庫的大型化、產(chǎn)業(yè)化和信息化，并且建立了較為完善的法規(guī)和技術(shù)指南。全球有代表性的生物樣本庫及其國際組織有泛歐洲生物樣本庫與生物分子資源研究平臺、英國生物樣本庫、卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院樣本庫、盧森堡聯(lián)合生物庫、加拿大組織庫協(xié)作網(wǎng)絡(luò)、國際生物和環(huán)境樣本庫協(xié)會[6-7]。

1.2 國內(nèi)生物樣本庫建設(shè) 國內(nèi)生物樣本庫近年來快速發(fā)展，與國外相比，雖起步較晚，但依托于強(qiáng)大的人口基數(shù)，我們迎頭趕上并且發(fā)展勢頭強(qiáng)勁。國內(nèi)的病種數(shù)量以及罕見病種生物樣本的數(shù)量是國外無法比擬的。早在1994年，中國科學(xué)院就建立了中華民族永生細(xì)胞庫，此后山東省臍帶血造血干細(xì)胞庫、北京臍帶血造血干細(xì)胞庫、復(fù)旦大學(xué)泰州健康科學(xué)研究院、SBC芯超生物銀行、深圳國家基因庫等專項(xiàng)生物樣本資源庫也相繼建立，以上都是較為成功的生物樣本庫[8-9]。

腫瘤?？粕飿颖編斓慕ㄔO(shè)隨著生物樣本庫行業(yè)的發(fā)展也在不斷的建設(shè)過程中，較為成功的如復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織庫、北京協(xié)和醫(yī)院臨床生物標(biāo)本中心、第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院生物樣本庫等專科樣本庫都有長足的發(fā)展，為?？茦颖編斓慕ㄔO(shè)積累了經(jīng)驗(yàn)[10-11]。

但隨著?？粕飿颖編斓目焖侔l(fā)展，問題也越來越凸顯，主要存在以下問題：①規(guī)模小，同一家醫(yī)院可能存在多個(gè)小型的科室樣本庫或課題樣本庫；②腫瘤?？茦颖編煸谌〔?、存儲、出庫等過程不同于其他類型的樣本庫，但是缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；③腫瘤專科樣本庫依托于本院臨床資源，在樣本數(shù)量上相比于綜合醫(yī)院處于劣勢，樣本的存儲和使用周轉(zhuǎn)率較小。

2 上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院生物樣本庫建設(shè)

2.1 樣本庫的組織構(gòu)建和管理 規(guī)范的生物樣本庫建設(shè)需要完善的組織構(gòu)架來實(shí)現(xiàn)。我院由分管科研的院領(lǐng)導(dǎo)牽頭頂層設(shè)計(jì)、科教部統(tǒng)籌協(xié)調(diào)、生物樣本庫管理委員會監(jiān)管和審批，并配備專業(yè)、專職的工作人員，負(fù)責(zé)生物樣本庫的建設(shè)和日常運(yùn)行及管理。將醫(yī)院原本的較為小型的科室樣本庫、課題樣本庫等收歸生物樣本庫統(tǒng)一管理，每一份樣本從收集到使用再到結(jié)果的反饋，都有清晰的記錄，保證了樣本的可追溯性，避免了生物樣本資源管理的混亂。

2.2 知情同意書的簽署 生物樣本采集知情同意書，由醫(yī)院倫理委員會審批通過。知情同意書放置于電子病歷中，在收集樣本之前，由醫(yī)生與患者溝通得到同意后簽署，若患者有疑問，由臨床醫(yī)生與生物樣本庫工作人員做進(jìn)一步的解釋，爭取患者的同意。

2.3 血液樣本的采集和處理 臨床上血液樣本的采集，由醫(yī)生開具醫(yī)囑，護(hù)士執(zhí)行醫(yī)囑采集血液。采集的血液樣本及時(shí)送到生物樣本庫，樣本庫工作人員盡快將血液樣本低溫離心并分裝，3 000 rpm×10 min，分裝成血漿、血沉棕黃層、紅細(xì)胞和血清，每份0.5 mL，分裝完成后貼標(biāo)簽立刻入庫，-80 ℃保存。短時(shí)間不能完成離心處理的血液樣本，于4 ℃保存，最長時(shí)間不超過4 h。

2.4 組織樣本的采集和處理 組織樣本的采集在病理科取材室進(jìn)行，在病理醫(yī)生做完術(shù)中病理并出具冰凍診斷報(bào)告后盡快取材。通常取腫瘤組織和配對的癌旁/正常組織，并且分裝成小份保存，便于樣本以后直接出庫，避免反復(fù)凍融生物樣本(圖1)。所有樣本的取材必須保證不能影響正常的病理診斷及后續(xù)治療，并且樣本庫為每個(gè)捐獻(xiàn)者留取一份副本，以保證不會因?yàn)殡S著生物樣本的出庫造成該樣本資源的耗竭。

圖1 組織樣本的采集

考慮到組織內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，樣本從手術(shù)離體到入庫，時(shí)間控制在15 min以內(nèi)，最長不超過30 min。并且將入庫時(shí)間作為樣本信息，記錄在生物樣本庫管理系統(tǒng)中，作為生物樣本的一個(gè)重要信息保存。

采集生物樣本有2種模式：①課題導(dǎo)向的生物樣本收集，臨床科研人員根據(jù)自身的課題需求，向生物樣本庫提出申請，收集某種特定的生物樣本，例如放化療后的胸腺癌、食管癌生物樣本；②以肺癌為主的胸部腫瘤樣本收集，包括肺癌(含少見腫瘤)、食管癌、縱隔腫瘤、心房粘液瘤、心瓣膜組織等，這種生物樣本收集方式不具體滿足某一課題要求，僅僅根據(jù)我院的?？铺厣M(jìn)行收集，以滿足大多數(shù)臨床科研人員的研究需求。

生物樣本的保存方式多種多樣，冷凍、RNAlater、蠟塊等方式，可根據(jù)自身單位的實(shí)際情況及課題的要求，選擇合適的保存方式。我院生物樣本庫采用冷凍及RNAlater保存方式，生物樣本取材后經(jīng)液氮快速冷凍，防止細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶損壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或活性分子的結(jié)構(gòu)，然后轉(zhuǎn)移到低溫存儲設(shè)備中。液氮快速冷凍時(shí)間不宜過長，否則液氮的低溫會使得凍存管密封圈失去效果，導(dǎo)致液氮進(jìn)入凍存管，一方面會導(dǎo)致樣本的交叉污染，另一方面在樣本出庫的過程中，凍存管內(nèi)的液氮迅速膨脹，極易發(fā)生爆管，造成傷害。另外，我院生物樣本庫也采用氣相液氮的保存方式，大型氣相液氮罐配備后備液氮供應(yīng)系統(tǒng)，能夠使得氣相液氮罐中一直處于氣相狀態(tài)，其溫度達(dá)到-190 ℃，既保證了樣本的低溫存儲，也很好的解決了液氮可能進(jìn)入凍存管的問題。另外，RNAlater能夠很好的保存組織RNA，向凍存管內(nèi)注入10倍于組織體積的RNAlater，-20 ℃保存。

我院生物樣本庫依托于豐富的臨床資源，是以胸部腫瘤為特色的生物樣本庫，現(xiàn)已收集樣本數(shù)量愈84 000份，捐獻(xiàn)者接近10 000例，并且隨著捐獻(xiàn)者數(shù)量和生物樣本數(shù)量的不斷增加，收集的生物樣本病種類型還在不斷的增加(圖2)。

圖2 生物樣本庫捐獻(xiàn)者數(shù)量和病種數(shù)量

2.5 生物樣本的質(zhì)量控制 生物樣本的質(zhì)量是樣本庫工作的核心，樣本應(yīng)在規(guī)范、嚴(yán)格的條件下進(jìn)行采集、處理、保存、運(yùn)輸及出庫，影響生物樣本質(zhì)量的因素包括分析前變量和分析變量。分析前變量包括生物變異、樣本收集、處理和存儲等過程[12-15]，對生物樣本質(zhì)量影響較大。

2016年，由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織庫牽頭，上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院生物樣本庫參與編寫了《惡性腫瘤生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)操作流程》，將本院生物樣本庫實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)共享的同時(shí)，也吸收其他腫瘤?？茦颖編斓慕?jīng)驗(yàn)。參與翻譯《加拿大組織庫協(xié)作網(wǎng)絡(luò)標(biāo)準(zhǔn)操作流程》，借鑒國際上成功樣本庫的經(jīng)驗(yàn)，建設(shè)好本院的生物樣本庫。

2.5.1 組織樣本的病理評價(jià) 組織樣本在入庫前或者入庫后短時(shí)間內(nèi)，需要對樣本的病理狀況進(jìn)行評估，包括樣本的腫瘤細(xì)胞比例、腫瘤分級以及病理診斷等，必要時(shí)將樣本采集單位的病理報(bào)告和病理切片圖像資料等作為生物樣本信息錄入樣本庫信息管理系統(tǒng)。

2.5.2 總體分子水平評價(jià) 生物樣本庫的質(zhì)量評價(jià)一般針對總體分子水平的評價(jià)，RNA相對于DNA更容易發(fā)生破壞和降解，所以通常將RNA的完整性作為評價(jià)樣本的質(zhì)量指標(biāo)[10-11,13,15]。質(zhì)量評價(jià)是一個(gè)長期的系統(tǒng)性工作，我們從建庫初期就建立了每月隨機(jī)抽檢制度，抽取一定比例(5%～10%)的庫存標(biāo)本提取DNA/RNA(圖3)。同時(shí)我們還獲得由上海重大疾病臨床生物樣本庫質(zhì)量控制中心、上海醫(yī)藥臨床研究中心、上海生物樣本庫工程技術(shù)研究中心聯(lián)合頒發(fā)的質(zhì)控證書。

圖3 抽樣質(zhì)控樣本RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

2.5.3 生物樣本質(zhì)量信息反饋 生物樣本庫一個(gè)重要的工作是為研究人員提供質(zhì)量合格的生物樣本，并且提供生物樣本相關(guān)信息，而研究人員對生物樣本的使用過程也是對樣本質(zhì)量進(jìn)行進(jìn)一步檢測的過程，研究者將樣本使用過程中的質(zhì)量信息反饋給生物樣本庫，這對于生物樣本庫評估樣本質(zhì)量信息、改進(jìn)樣本采集處理、存儲過程、冷鏈運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)環(huán)節(jié)均有重要意義。質(zhì)量控制體系也可根據(jù)研究人員的信息反饋進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，從而更加全面、有效地反映生物樣本庫存儲樣本的質(zhì)量信息。

2.6 生物樣本信息化建設(shè) 生物樣本庫的核心建設(shè)是數(shù)據(jù)庫建設(shè)，因此，全面又準(zhǔn)確地錄入與生物樣本的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)是信息管理系統(tǒng)的重要組成部分[16-17]，以便對樣本進(jìn)行注釋，包括實(shí)體腫瘤的大小、種類、數(shù)量、原發(fā)位置、冷缺血時(shí)間、入庫時(shí)間等，捐獻(xiàn)者基本信息、檢驗(yàn)信息、病理信息、影像資料等，捐獻(xiàn)者的術(shù)后治療、術(shù)后用藥和復(fù)發(fā)情況等隨訪信息。

生物樣本庫建設(shè)之初，我們是由人工將樣本信息錄入信息管理系統(tǒng)，但隨著生物樣本的入庫和出庫量逐漸增多，人工錄入既耗時(shí)耗力又易出錯(cuò)。目前我們采用間接信息對接的方式，即在病歷系統(tǒng)和樣本庫信息管理系統(tǒng)之間建立一個(gè)數(shù)據(jù)平臺，通過特定字段讀取自動錄入所需的與生物樣本關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)化信息，不僅實(shí)現(xiàn)了信息錄入的自動化操作，又避免了接口的直接對接可能產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。

2.7 生物樣本的使用與共享 每一份使用生物樣本的申請，必須是經(jīng)過倫理委員會審核且在科教部備案的科研項(xiàng)目。通過院內(nèi)協(xié)同辦公平臺提交給生物樣本庫審核，是否有適合申請者所需的生物樣本，隨后轉(zhuǎn)發(fā)給科教部及分管院長審批，規(guī)范的申請和審批流程保證每一份出庫的生物樣本都有據(jù)可查。腫瘤?？粕飿颖編煸跀?shù)量上無法比擬綜合醫(yī)院生物樣本庫，故收集的樣本要能使用起來，才能真正體現(xiàn)生物樣本庫的價(jià)值所在，我院所有生物樣本的申請均免費(fèi)使用，保證院內(nèi)每一個(gè)想做科研能做科研的人員能夠用得上樣本庫的每一份樣本。 真正實(shí)現(xiàn)了生物樣本的共享、服務(wù)于醫(yī)院的臨床醫(yī)學(xué)研究事業(yè)。

同時(shí)，依托于上海市科學(xué)技術(shù)委員會-上海市專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺項(xiàng)目“常見惡性腫瘤生物樣本庫網(wǎng)絡(luò)建設(shè)”項(xiàng)目，與上海復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院及滬上其他8家三級甲等醫(yī)院共同建立了“上海市惡性腫瘤生物樣本庫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)”，目前已共享2 000例肺癌生物樣本。利用“互聯(lián)網(wǎng)+樣本庫”，形成具有檢索、臨床病理診斷、藥物治療、檢驗(yàn)、影像、樣本存儲、樣本服務(wù)、網(wǎng)絡(luò)協(xié)同辦公及冷鏈物流等信息的一站式惡性腫瘤生物樣本庫專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺。

3 結(jié)語與展望

上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院生物樣本庫中收集的每一份生物樣本均遵照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、質(zhì)量合格、信息完整，以保證每一份生物樣本都具有科研價(jià)值；通過規(guī)范的網(wǎng)絡(luò)申請及審批流程、內(nèi)部質(zhì)量控制體系和定期的評估機(jī)制，生物樣本的使用和共享得以真正實(shí)現(xiàn)，才能充分發(fā)揮生物樣本資源的價(jià)值，生物樣本庫也因此充滿活力，在臨床科研工作中發(fā)揮重要的支撐作用。