體外產氣法研究牛至油對綿羊瘤胃發(fā)酵特性和甲烷產量的影響

張 然 鄭 琛 閆曉剛 梁 浩 楊華明*

(1.吉林省農業(yè)科學院畜牧科學分院，公主嶺 136100；2.甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

牛至油(oregano essential oil，OEO)是從植物牛至的葉和花中提取的一種揮發(fā)性植物油，含有30多種抗菌性的化合物，其活性成分主要為香芹酚(carvacrol，又稱香荊介酚，化學名為2-甲基-5-異丙基苯酚)和百里酚(thymol，又稱麝香草酚，化學名為5-甲基-2-異丙基苯酚)[1]，是我國農業(yè)部批準使用的抗菌促生長添加劑。目前國內外已有較多的研究發(fā)現(xiàn)，在反芻動物飼糧中添加牛至油可調控瘤胃發(fā)酵，能降低瘤胃內甲烷排放[2]和氨氮濃度[3-4]，提高動物生產性能[5]。隨著全球變暖日益加劇，溫室效應氣體(二氧化碳、甲烷和氧化亞氮)減排越來越受到人們的廣泛關注，就單一氣體而言，甲烷具有大氣壽命較長的特性，增溫潛力大約是二氧化碳的25倍[6]。瘤胃內82%的甲烷是通過甲烷短桿菌利用瘤胃中的代謝氫還原二氧化碳生成，但甲烷不被動物機體利用而通過噯氣排出體外[7]，因而生甲烷過程伴隨著較大的能量損失。牛至油作為飼料添加劑可控制溫室效應氣體排放，減少動物體內能量損失，提高飼料利用率。因此，深入研究牛至油在動物生產中的應用具有重要意義。綜上，本試驗通過體外產氣法研究不同牛至油添加水平對綿羊瘤胃發(fā)酵特性和甲烷產量的影響，旨在獲取牛至油的最適添加水平，為牛至油在反芻動物養(yǎng)殖中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛至油購自濟南上達生物工程有限公司，純度為90%。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

提供瘤胃液的動物為4只裝有永久瘤胃瘺管的新疆細毛羊與杜泊羊雜交的4周歲公綿羊，體重為(40.83±4.11) kg，參照《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)推薦的營養(yǎng)需要配制基礎飼糧，精粗比為30∶70，其組成及營養(yǎng)水平見表1。每天于07:00和17:00等量飼喂2次，先粗后精，自由飲水。在采集瘤胃液進行體外產氣試驗之前先預飼10 d。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet：Fe 38 mg，Zn 44 mg，Cu 15 mg，I 0.5 mg，Mn 50 mg，Se 0.3 mg，Co 0.05 mg，VA 354 IU，VD 94.4 IU，VE 1.06 mg。
2)消化能為實測值,其余為計算值。DE was a measured value, while the others were calculated values.

1.3 試驗設計

本試驗采用單因素完全隨機試驗設計，體外發(fā)酵系統(tǒng)有6個發(fā)酵罐(每個發(fā)酵罐的有效容積為200 mL)，其中1個發(fā)酵罐設為空白對照組(不添加發(fā)酵底物和牛至油，用于發(fā)酵罐中產氣量的校正)，其余5個發(fā)酵罐添加培養(yǎng)液+發(fā)酵底物+牛至油，牛至油在培養(yǎng)液中的濃度分別設為0(對照)、100、200、300和400 mg/L，發(fā)酵12 h，試驗連續(xù)進行5 d，即每個添加水平設置5個重復。

1.4 體外產氣試驗

1.4.1 裝置

體外產氣試驗裝置為吉林省農業(yè)科學院畜牧科學分院自主研制的“六通路瞬時發(fā)酵微量產氣全自動記錄裝置與軟件系統(tǒng)”，型號為Qtfxy-6。該裝置主體由恒溫厭氧發(fā)酵系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成，恒溫厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的6個白鋼發(fā)酵罐外連有2根乳膠管，一根連接氮氣罐，在發(fā)酵過程中，氮氣以一定流速不斷進入發(fā)酵罐以保證厭氧環(huán)境，另一根連接到數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，將發(fā)酵過程中產生的氣體送至數(shù)據(jù)采集儀器，利用甲烷(德國Semsorseurope公司)、二氧化碳(德國Semsorseurope公司)、氧氣(美國AMI公司)和氫氣(英國CITY公司)濃度傳感器對氣體進行檢測。數(shù)據(jù)采集儀器每間隔1 min依次單獨采集各發(fā)酵罐(1～6)內氣體數(shù)據(jù)，每6 min循環(huán)1次。

1.4.2 緩沖液的制備

厭氧人工瘤胃緩沖液按Menke等[8]方法配制。

1.4.3 瘤胃液的采集

試驗當日晨飼前，利用負壓原理從4只瘺管羊瘤胃內不同部位采集足量瘤胃液，厭氧無菌條件下攪拌后經4層紗布過濾分離固體和液體部分。

1.4.4 試驗過程

培養(yǎng)液為150 mL，由1∶2的瘤胃液和緩沖液組成。培養(yǎng)底物取樣2 g，為精粗比為30∶70的飼糧(表1)。牛至油的添加方式：分別稱取0、150、300、450和600 mg牛至油溶于10 mL無水乙醇中，使得牛至油濃度分別為0、15、30、45和60 mg/mL，取1 mL上述不同牛至油濃度的溶液加入到相應的培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液濃度依次達到0、100、200、300和400 mg/L，空白對照組加入1 mL無水乙醇。水浴搖床溫度39 ℃，轉速為80 r/min。

1.4.5 樣品采集

于發(fā)酵罐培養(yǎng)12 h后立即測定pH，然后采集培養(yǎng)液于-20 ℃冷凍保存，以測定總氮、氨氮、尿素氮和揮發(fā)性脂肪酸濃度。

1.5 測定指標及測定方法

pH：用酸度計(pHS-3C，上海雷磁儀器廠)測定。

揮發(fā)性脂肪酸濃度：用氣相色譜儀(6890N，Agilent，美國)測定。色譜柱為HP19091N-213型毛細管柱(Agilent，美國)。色譜條件:進樣口溫度220 ℃，氮氣流量2.0 mL/min，分流比為40∶1，進樣量0.6 μL，程序升溫模式(120 ℃ 3 min然后以10 ℃/min升至180 ℃，保持1 min)，火焰氫離子檢測器(FID)溫度250 ℃，F(xiàn)ID空氣、氫氣和氮氣流量分別為45、40、45 mL/min。

總氮濃度:用凱氏定氮法[9]測定。

氨氮濃度:按馮宗慈等[10]改進的比色法測定。

尿素氮濃度:用二乙酰一肟法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

蛋白氮濃度計算公式如下：

蛋白氮(mg/dL)=總氮(mg/dL)-氨氮(mg/dL)-尿素氮(mg/dL)。

總產氣量和甲烷產量：由數(shù)據(jù)分析儀采集并被實時記錄。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件的one-way ANOVA法進行方差分析，差異顯著時，采用Turkey法(方差齊)或Tamhane法(方差不齊)進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著的判斷標準。

2 結 果

2.1 培養(yǎng)液pH及揮發(fā)性脂肪酸濃度和比例

由表2可知，與對照組相比，各試驗組培養(yǎng)液的pH分別提高了的2.6%、5.6%、7.2%和6.8%，均顯著地高于對照組(P<0.05)。300、400 mg/L組與其余組相比，培養(yǎng)液總揮發(fā)性脂肪酸濃度和丙酸比例均顯著降低(P<0.05)，培養(yǎng)液乙酸比例和乙酸/丙酸顯著增加(P<0.05)。培養(yǎng)液丁酸和其他酸的比例變化是一致的，200 mg/L組顯著高于對照組(P<0.05)，400 mg/L組顯著低于對照組(P<0.05)。

表2 牛至油對體外發(fā)酵培養(yǎng)液pH及揮發(fā)性脂肪酸濃度和比例的影響Table 2 Effects of oregano oil on pH and volatile fatty acid concentrations and proportions in culture medium of in vitro fermentation

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 培養(yǎng)液氮濃度

由表3可知，與對照組相比，培養(yǎng)液氨氮濃度除100 mg/L組外其余各試驗組都顯著降低(P<0.05)。300 mg/L組培養(yǎng)液總氮濃度顯著高于100和400 mg/L組(P<0.05)，與其余各組差異不顯著(P>0.05)。各試驗組培養(yǎng)液尿素氮濃度跟對照組相比差異不顯著(P>0.05)，400 mg/L組顯著高于200 mg/L組(P<0.05)。300 mg/L組培養(yǎng)液蛋白氮濃度顯著高于400 mg/L組(P<0.05)，其余各組間差異均不顯著(P>0.05)。

2.3 總產氣量和甲烷產量

由表4可知，總產氣量和甲烷產量的變化是一致的，即與對照組相比，300和400 mg/L組總產氣量和甲烷產量顯著降低(P<0.05)，其余各組間均沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 牛至油對體外發(fā)酵培養(yǎng)液氮濃度的影響Table 3 Effects of oregano oil on nitrogen concentration in culture medium of in vitro fermentation mg/dL

表4 牛至油對體外發(fā)酵總產氣量和甲烷產量的影響Table 4 Effects of oregano oil on total gas production and methane production of in vitro fermentation mL/g

不同時間點各組甲烷產量的動態(tài)變化如圖1所示。在各時間點，對照組甲烷產量均為最高，300和400 mg/L組大幅低于對照組。

圖1 牛至油對體外發(fā)酵甲烷產量的影響Fig.1 Effects of oregano oil on methane production of in vitro fermentation

3 討 論

3.1 牛至油對體外發(fā)酵培養(yǎng)液pH及揮發(fā)性脂肪酸濃度和比例的影響

瘤胃液pH是判斷反芻動物瘤胃是否酸中毒的主要指標，而揮發(fā)性脂肪酸和乳酸濃度是導致瘤胃液pH變化的主要因素[11]。本試驗中，各試驗組培養(yǎng)液的pH在6.63～7.17，均顯著高于對照組，在有利于瘤胃微生物生長、發(fā)育及發(fā)酵的pH范圍(5.5～7.5)內[12]，說明牛至油能提高體外培養(yǎng)液的pH。徐方華[13]利用瘤胃體外批次培養(yǎng)方法，以精粗比為60∶40的飼糧為底物，研究不同添加水平(0、27、53、80 mg/dL)牛至油對黃牛瘤胃發(fā)酵特性的影響，結果表明，各牛至油添加組與對照組相比，提高了培養(yǎng)液pH且pH與添加水平成正比。Evans等[14]研究表明，麝香草酚抑制與瘤胃能量代謝相關的牛鏈球菌和反芻獸新月單胞菌的生長，這2種菌均降低了乳酸濃度。乳酸是一種強酸，解離系數(shù)(pKa，3.9)低于揮發(fā)性脂肪酸的解離系數(shù)(4.8)，對瘤胃液pH的貢獻率是揮發(fā)性脂肪酸的近10倍[15-16]，從而降低瘤胃內有機酸的積累，使瘤胃液pH升高。

揮發(fā)性脂肪酸是瘤胃微生物發(fā)酵的終產物，是供應反芻動物能量代謝的主要形式[17]，因此認為會降低總揮發(fā)性脂肪酸濃度的任何牛至油添加水平對反芻動物都是不利的。本試驗中高添加水平(300、400 mg/L)的牛至油顯著降低了總揮發(fā)性脂肪酸濃度(分別降低了21.6%、35.5%)和丙酸比例(分別降低了21.3%、24.9%)，并顯著增加了乙酸比例(分別增加了3.8%、7.3%)和乙酸/丙酸(分別增加了32.3%、43.2%)，說明添加牛至油濃度在300 mg/L以上時抑制了瘤胃發(fā)酵和微生物的活性。林波等[18]用體外法研究了牛至油及其主要成分香芹酚對體外瘤胃發(fā)酵的影響，在培養(yǎng)液中添加0、50、200、500和 750 mg/L牛至油，發(fā)現(xiàn)總揮發(fā)性脂肪酸濃度隨牛至油添加水平的增加而降低，且高添加水平(500、750 mg/L)的牛至油時瘤胃發(fā)酵過程受到抑制，這種影響歸因于細胞膜完整性的喪失和葡萄糖攝取量的降低[14]。Castillejos等[19]在研究不同植物油在不同濃度水平(5、50、500、5 000 mg/L)下對體外發(fā)酵培養(yǎng)液發(fā)酵產物濃度的影響中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，培養(yǎng)液中添加500 mg/L百里酚，能顯著降低總揮發(fā)性脂肪酸濃度、丙酸比例和顯著升高pH、乙酸比例和乙酸/丙酸，而低添加水平(5、50 mg/L)下對以上指標均沒有顯著性影響。Patra等[20-21]試驗表明，體外培養(yǎng)液中添加牛至油會減少瘤胃原蟲、細菌和主要纖維素分解菌(產琥珀酸絲狀桿菌、黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌)的數(shù)量，且與牛至油的添加水平呈線性關系。本試驗中總揮發(fā)性脂肪酸濃度隨牛至油添加水平的增加而降低，但存在劑量效應，可能是因為高添加水平的牛至油抑制了瘤胃內纖維素分解菌和原蟲對纖維類飼料的降解，引起總揮發(fā)性脂肪酸濃度降低。但也有研究表明，培養(yǎng)液中添加植物油對總揮發(fā)性脂肪酸濃度沒有影響[22-23]或增加總揮發(fā)性脂肪酸濃度[24-25]。分析原因可能是因為植物精油的添加水平和主要成分的化學結構決定了其作用效果。植物精油對單個揮發(fā)性脂肪酸的作用是不一樣的。有研究報道，植物精油選擇性抑制瘤胃內菌群，高添加水平的牛至油促進了革蘭氏陽性菌(乙酸的生產者)的產生，并抑制了革蘭氏陰性菌(丙酸的生產者)的生成，使乙酸比例增加，丙酸比例降低，從而也升高了乙酸/丙酸[14]。本試驗結果與上述研究結果一致。

3.2 牛至油對體外發(fā)酵培養(yǎng)液氮濃度的影響

本試驗中各試驗組總氮、尿素氮和蛋白氮濃度與對照組相比，差異均不顯著，氨氮濃度在8.81～12.64 mg/dL，在瘤胃內氨氮濃度的變化范圍(85～300 mg/L)內[26]。與對照組相比，添加100、200、300和400 mg/L的牛至油使氨氮濃度分別降低9.8%、21.0%、13.1%和20.3%，添加100 mg/L以上的牛至油時才能顯著降低培養(yǎng)液的氨氮濃度。本試驗與白烏日汗[27]結果相一致，體外培養(yǎng)液中分別添加不同濃度(0、45、450和4 500 mg/L)的牛至油和麝香草酚時，在培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)當牛至油濃度為45 mg/L時試驗組與對照組沒有顯著差異，而其余各試驗組均顯著低于對照組，添加麝香草酚的各試驗組均顯著低于對照組。本試驗與Castillejos等[19]、Cobellis等[2]結果類似。植物精油降低培養(yǎng)液氨氮濃度的原因有：植物精油能夠抑制瘤胃超級產氨菌(如斯蒂克蘭德氏梭菌、厭氧消化鏈球菌)的生長，降低脫氨酶活性，導致氨基酸脫氨基作用降低[28-29]；原蟲是瘤胃內氨氮的凈產生微生物，通過抑制原蟲數(shù)量降低瘤胃內氨氮濃度[30]。

3.3 牛至油對體外發(fā)酵總產氣量和甲烷產量的影響

總產氣量是反映飼料可發(fā)酵程度及瘤胃微生物活性的重要指標[31]。反芻動物瘤胃內合成甲烷的主要途徑是氫氣還原二氧化碳形成甲烷，其次是乙酸、甲酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸合成甲烷[12]，因此任何一種影響甲烷形成途徑的因素都會導致甲烷產量的變化。本試驗結果表明，添加牛至油時，總產氣量隨添加濃度的增加而降低，且高添加水平(300、400 mg/L)下顯著降低了總產氣量，抑制了瘤胃的發(fā)酵。同樣，只有高添加水平(300、400 mg/L)的牛至油才會顯著降低甲烷產量。Evans等[14]的試驗表明，在體外瘤胃培養(yǎng)過程中，當麝香草酚的添加水平分別為50、100和200 mg/L時均沒有影響甲烷產量，而添加水平為400 mg/L時顯著降低了甲烷產量。Chaudhary等[32]報道，添加450 mg/L的百里香油和牛至油能顯著降低體外發(fā)酵甲烷產量(分別降低了68.8%、82.5%)，而50和150 mg/L的添加水平對甲烷產量沒有顯著影響。Günal等[33]、Macheboeuf等[34]的研究結果也與本試驗結果一致，這可能是因為瘤胃微生物對低添加水平的植物精油產生耐受性，導致植物精油對甲烷產量影響不顯著。Wang等[35]體內試驗表明，添加0.25 g/d的牛至油混合物能降低綿羊的甲烷產量。有學者認為，植物精油通過直接抑制產甲烷菌的活性或間接減少與產甲烷菌共生的原蟲數(shù)量來降低瘤胃內的甲烷產量[20-21,36]。也有理論認為，瘤胃內丙酸比例和甲烷產量之間存在負相關，因為丙酸是氫的受體，在形成過程中可利用合成甲烷所需要的氫，導致甲烷產量降低[12]。本試驗結果未顯示出這種變化，具體原因還需進一步剖析。

4 結 論

① 高添加水平(300、400 mg/L)的牛至油在顯著降低甲烷產量的同時也顯著降低了總產氣量和總揮發(fā)性脂肪酸濃度，抑制瘤胃發(fā)酵，對反芻動物營養(yǎng)是不利的，而添加200 mg/L牛至油對總產氣量和總揮發(fā)性脂肪酸濃度沒有顯著影響，但顯著降低了氨氮濃度。

② 綜合各項指標得出，在體外條件下牛至油最適添加水平為200 mg/L。