維生素A對奶牛乳腺上皮細胞乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因表達的影響

蘇 芮 劉 陽 閆素梅 史彬林 趙艷麗 石惠宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

乳脂和乳蛋白作為牛奶的主要成分，是衡量乳制品的重要營養(yǎng)指標。維生素A(vitamin A)是維持動物機體正常生理代謝的必需營養(yǎng)素之一。維生素A能通過調(diào)控多種基因的表達來影響動物機體的生長發(fā)育、免疫及代謝，也能對多種動物的脂類代謝產(chǎn)生影響。王文娟等[1]發(fā)現(xiàn)飼糧維生素A水平的降低會提高牛肉大理石花紋的得分，而Arnett等[2]結(jié)果表明，羔羊飼糧中補飼高水平的維生素A 112 d可以提高其總肌內(nèi)脂肪含量；丁明巖[3]研究發(fā)現(xiàn)，在石斑魚飼料中添加2 000～4 000 IU/kg維生素A時，脂類分解代謝得到顯著提高，顯著高于0和2 000 IU/kg組。這些結(jié)果說明維生素A對動物的脂類代謝有顯著的影響。Oldman等[4]研究表明，在分娩前60 d到產(chǎn)后42 d，奶牛飼喂170 000 IU/d的維生素A與飼喂50 000 IU/d的維生素A相比，產(chǎn)奶量顯著提高，包括乳脂、乳蛋白等在內(nèi)的乳成分的合成也增加。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加高劑量(220 IU/kg BW)的過瘤胃保護維生素A，奶牛產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率以及日均乳脂產(chǎn)量和乳蛋白產(chǎn)量有高于低劑量(110 IU/kg BW)組的趨勢[5]。然而，關(guān)于維生素A是否對奶牛的乳脂、乳蛋白合成產(chǎn)生影響的報道甚少。奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)是乳脂和乳蛋白合成與分泌的重要場所，其細胞的生物合成能力決定了奶牛乳腺的泌乳能力。因此，本試驗選用BMECs為模型，以乳脂和乳蛋白合成相關(guān)酶活性及基因表達量為考察指標，研究維生素A對乳脂和乳蛋白合成的影響，為奶牛生產(chǎn)中維生素A的合理添加以及改善乳成分的組成提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

膠原酶Ⅱ(17101-015)、DMEM/F12基礎培養(yǎng)基(12400-024)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉(51500-056)、胎牛血清(FBS，10099-141)、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA，25300054)和雙抗(15140-122)購自Gibco公司；兩性霉素B(AE437)、催乳素(PRL，L6520)、視黃酸(RA，R2625)、表皮生長因子(EGF，E4127)、氫化可的松(IJ0135)購自Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Amresco公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自HyClone公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(DRR036A)、SYBR Premix Ex TagTMⅡ(DRR820A)、RNAiso Plus(D9109B)購自寶生物工程(大連)有限公司；氯仿、無水乙醇、異丙醇購自天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 試劑配制

生長培養(yǎng)基：在每100 mL DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中添加FBS 10 mL，雙抗2 mL，胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉0.5 mL，PRL、兩性霉素B和氫化可的松各100 μL及EGF 10 μL。

維生素A貯備液的配制：將100 mg RA(維生素A的主要活性代謝物質(zhì))溶于5 mL DMSO溶液，配制成20.00 mg/mL維生素A原液，再將其稀釋成濃度分別為0、0.05、0.10、0.20、1.00和2.00 mg/mL的維生素A貯備液，0.22 μmol/L濾器過濾。

1.3 BMECs的培養(yǎng)

BMECs培養(yǎng)采用膠原酶消化法。從屠宰場取健康荷斯坦奶牛乳腺組織低溫保存運回實驗室，剪為1 cm×1 cm×1 cm大小的組織塊，用3×雙抗PBS將其清洗3遍，75%酒精清洗30 s，1×雙抗PBS清洗3遍，剪取腺泡豐富的部位放入5 mL無酶無菌離心管中，剪碎至糊狀后加入等體積0.5%的膠原酶Ⅱ，37 ℃消化1 h，每20 min上下顛倒混勻，使其充分消化。80目濾網(wǎng)過濾，172×g離心5 min，PBS沖洗1次，再離心細胞3 min，之后用生長培養(yǎng)基懸浮接種于25 cm透氣細胞瓶內(nèi)，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至細胞貼壁至90%，之后用0.05%胰蛋白酶/EDTA純化和傳代細胞。

1.4 試驗設計

試驗采用單因素完全隨機試驗設計，將貼壁生長的第3代BMECs隨機分為6個處理，每個處理6個重復。使用無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h后，添加維生素A濃度分別為0、0.05、0.10、0.20、1.00和2.00 μg/mL的培養(yǎng)基，其中0 μg/mL維生素A組為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按照試驗要求的細胞收集方法進行細胞收集和相關(guān)指標的測定。

1.5 測定指標與方法

細胞活力用MTT比色法[6]檢測，以細胞相對增殖率(RGR)表示。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL MTT，4 h后棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，用全自動酶標儀檢測490 nm波長下各培養(yǎng)孔的吸光度(OD)值。

RGR(%)=(試驗組OD490 nm/對照組OD490 nm)×100。

細胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量依照試劑盒(E1013，北京普利萊基因技術(shù)有限公司)說明書要求進行測定。細胞培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，用PBS洗滌2次，每孔加入200 μL裂解液作用10 min，收集裂解液于1.5 mL離心管中，1 200×g離心5 min，取上清70 ℃加熱10 min，424×g離心5 min后取上層清液進行測定。

以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR儀(ABI-7500，ABI公司)測定細胞內(nèi)乳脂、乳蛋白合成相關(guān)基因的表達量。測定基因主要包括乳脂合成相關(guān)基因脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)、脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)、脂蛋白酯酶(LPL)、脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)、過氧化酶體增殖物激活受體γ(PPARG)，乳蛋白合成相關(guān)基因αs1-酪蛋白(CSN1S1)、β-酪蛋白(CSN2)、κ-酪蛋白(CSN3)、真核起始因子4E(eIF4E)、真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)、信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)，其引物序列及參數(shù)見表1。反應程序為：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，進行40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；熔解曲線為：70～95 ℃，每6 s升溫0.5 ℃，共51個循環(huán)，基因的表達量采用2-△△Ct法進行計算。

表1 引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequence and parameters

F:上游引物；R:下游引物。
F: forward primer； R: reverse primer.

乳脂和乳蛋白合成相關(guān)酶活性和蛋白含量按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒的操作說明書進行，主要包括BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)酶脂肪酸合成酶(FAS)、ACACA、LPL、SCD的活性，乳蛋白合成相關(guān)酶S6K1的活性以及mTOR的含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SAS 9.0軟件ANOVA程序進行方差分析，并用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05為差異顯著判斷標準，0.05≤P<0.10為差異趨于顯著判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 RGR、TG含量和乳脂合成相關(guān)基因的表達

由表2可知，1.00、2.00 μg/mL維生素A組的RGR和TG含量顯著高于對照組(P<0.05)。對于FASN基因表達量，以0.10 μg/mL維生素A組最高，顯著高于對照組(P<0.05)，與0.05 μg/mL維生素A組差異不顯著(P>0.05)；對于ACACA基因表達量，除2.00 μg/mL維生素A組外的所有維生素A組均顯著高于對照組(P<0.05)，且以0.10 μg/mL維生素A組最高；所有維生素A組的PPARG基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)，以1.00 μg/mL維生素A組最高；對于SREBP1、SCD基因表達量，以0.05、0.10 μg/mL維生素A組顯著高于對照組(P<0.05)，0.20、1.00、2.00 μg/mL維生素A組與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表2 維生素A對BMECs內(nèi)RGR、TG含量和乳脂合成相關(guān)基因表達的影響Table 2 Effects of vitamin A on intracellular RGR， TG content and mRNA expression related to milk fat synthesis in BMECs

同行數(shù)據(jù)肩標相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 乳蛋白合成相關(guān)基因的表達

由表3可知，0.05和0.10 μg/mL維生素A組的CSN1S1基因表達量較高，顯著高于對照組和其他維生素A組(P<0.05)，且0.20和1.00 μg/mL維生素A組顯著高于對照組(P<0.05)。對于CSN3基因表達量，0.10 μg/mL維生素A組顯著高于對照組及0.20、1.00、2.00 μg/mL維生素A組(P<0.05)，0.20、1.00和2.00 μg/mL維生素A組與對照組無顯著差異(P>0.05)；對于mTOR基因表達量，0.10 μg/mL維生素A組顯著高于對照組(P<0.05)，其他維生素A組與對照組無顯著差異(P>0.05)；對于STAT5基因表達量，以0.05、0.10和0.20 μg/mL維生素A組較高，尤以0.20 μg/mL維生素A組最高，顯著高于對照組(P<0.05)，其他各維生素A組與對照組無顯著差異(P>0.05)；0.10、1.00 μg/mL維生素A組的eIF4E基因表達量相比對照組有增加的趨勢(P=0.07)。

2.3 乳脂和乳蛋白合成相關(guān)酶活性和蛋白含量

由表4可知，對于ACACA活性，除2.00 μg/mL維生素A組與對照組無顯著差異(P>0.05)外，其他維生素A組均顯著高于對照組(P<0.05)，且以0.10 μg/mL維生素A組最高；維生素A對乳脂合成相關(guān)酶FAS和LPL活性無顯著的影響(P>0.05)，但從數(shù)值上看，0.05和0.10 μg/mL維生素A組的FAS活性最高，且高于其他各組；SCD的活性以0.05、0.10 μg/mL 維生素A組趨于顯著地高于對照組(P=0.08)；相比對照組，1.00 μg/mL維生素A組提高了mTOR含量，但差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于0.05、0.20和2.00 μg/mL維生素A組(P<0.05)。0.10和1.00 μg/mL維生素A組S6K1活性略高于其他各組，但差異不顯著(P>0.05)。

表3 維生素A對BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達的影響Table 3 Effects of vitamin A on mRNA expression related to milk protein synthesis in BMECs

表4 維生素A對BMECs內(nèi)乳脂和乳蛋白合成相關(guān)酶活性和蛋白含量的影響Table 4 Effects of vitamin A on enzyme activity and protein content related to milk fat and protein synthesis in BMECs

3 討 論

3.1 維生素A對BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因表達的影響

乳脂主要由TG組成，其含量約占所有乳脂成分的98%。乳腺中從頭合成及從血液吸收的脂肪酸在BMECs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成TG，隨后形成大小不一的脂滴分泌至胞外[10]。本試驗中，1.00、2.00 μg/mL的維生素A增加了BMECs的RGR及TG含量，說明維生素A可以促進BMECs內(nèi)乳脂的合成。ACACA和FASN在BMECs內(nèi)作用于乙酸和β-羥丁酸使其從頭合成中短鏈脂肪酸，乳中約1/2的C16∶0和幾乎全部的C4∶0～C14∶0依賴于乳腺的從頭合成。ACACA是脂肪酸合成第1階段的限速酶，中鏈脂肪酸的合成則主要通過FASN，且FASN會參與其碳鏈延長的整個過程。本試驗結(jié)果表明，添加維生素A可提高BMECs內(nèi)ACACA、FASN基因的表達量，說明維生素A可能促進了BMECs內(nèi)脂肪酸的從頭合成，引起TG含量的上升。張娜等[11]分析了不同乳品質(zhì)奶牛乳腺中乳脂合成相關(guān)基因的表達，結(jié)果表明高乳品質(zhì)奶牛的乳腺中FASN基因的表達量低于低乳品質(zhì)的奶牛，而二者的ACACA活性無顯著差異，表明ACACA雖然是脂肪酸從頭合成的重要限速酶，但酶活性卻不是影響乳中脂肪含量的主要因素。在本試驗中，維生素A提高了BMECs中TG含量，但其促進濃度和ACACA、FASN基因表達的不一致，說明TG含量的增加可能不是完全通過促進脂肪酸的從頭合成來實現(xiàn)的，具體原因還有待于進一步研究。PPARG、SREBP1分別屬于核轉(zhuǎn)錄因子家族和核激素受體家族中的配體激活受體，二者作為脂肪合成基因網(wǎng)絡中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，都能直接調(diào)控ACACA、FASN、SCD、LPL等靶基因，進而調(diào)節(jié)脂肪酸的轉(zhuǎn)運、合成及去飽和過程。脂肪合成相關(guān)基因的表達量和酶活性都是調(diào)控反芻動物乳脂分泌的重要因素[12]，長鏈脂肪酸進入BMECs后需要去飽和[13]。SCD則是催化飽和脂肪酸形成單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵限速酶，SCD的催化產(chǎn)物是TG合成的重要組成部分。有研究表明，激活的PPAR可以和類維生素A X受體(retinoids X recepter，RXR)形成異源二聚體，然后和靶基因PPARG相互作用來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達，而維生素A的代謝產(chǎn)物9-cis RA是RXR的有效配體[14]。本試驗結(jié)果得出，維生素A上調(diào)了PPARG、SREBP1和SCD基因表達的同時，也促進ACACA、FASN基因的表達，且ACACA、FASN、SCD活性與其靶基因的表達量也呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，提示添加維生素A增加了BMECs內(nèi)的TG含量，可能與提高了PPARG、SREBP1的基因表達量進而上調(diào)其下游靶基因FASN、ACACA、SCD等脂肪酸合成相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，但關(guān)于具體機制的研究報道甚少，需要進一步探討。

本試驗中，維生素A對BMECs內(nèi)乳脂的合成與其濃度有關(guān)，1.00、2.00 μg/mL的維生素A對細胞內(nèi)TG含量促進效果較好；各濃度維生素A對FASN、ACACA、PPARG、SCD基因表達均有促進效果，F(xiàn)ASN、SREBP1、SCD基因表達量均以0.05和0.10 μg/mL維生素A組較高；ACACA以0.10 μg/mL維生素A組增加效果最為明顯；PPARG尤以1.00 μg/mL上調(diào)作用最明顯。2.00 μg/mL的維生素A雖然對TG含量具有促進效果，但乳脂合成相關(guān)基因表達量與對照組相比差異不顯著。綜合考慮，以0.10 μg/mL的維生素A對BMECs乳脂合成的促進作用較強。

3.2 維生素A對BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達的影響

乳蛋白主要由酪蛋白組成，約占80%，包括CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3，其中CSN1S1和CSN3是反映乳蛋白合成的主要蛋白質(zhì)，其基因表達量可反映BMECs內(nèi)乳蛋白的合成水平[15]。乳蛋白合成主要由2條信號通路來調(diào)控，分別是主要在PRL作用下從基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控乳蛋白合成的Juns激酶(JAK)-信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號通路[16]和從蛋白質(zhì)翻譯水平起生乳調(diào)節(jié)作用的mTOR信號通路[17]。mTOR屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶超家族，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。在奶牛乳腺組織中，mTOR信號通路能控制乳蛋白相關(guān)基因的翻譯，S6K1是mTOR的下游調(diào)節(jié)激酶，二者的磷酸化激活可促進BMECs內(nèi)乳蛋白的合成。本試驗結(jié)果表明，添加一定濃度的維生素A能顯著提高CSN1S1和CSN3的基因表達量，同時顯著提高STAT5的基因表達量。結(jié)果也得出，0.10和1.00 μg/mL維生素A組的mTOR和eIF4E的基因表達量高于對照組，mTOR含量和S6K1活性也有相似的變化規(guī)律，提示維生素A可能是通過mTOR信號通路使mTOR和S6K1激活從而促進乳蛋白合成。這些結(jié)果說明，維生素A對CSN1S1和CSN3基因表達有提高的作用可能與mTOR和STAT5信號通路有關(guān)，但相關(guān)研究鮮有報道，需要進一步研究。胰島素樣生長因子(IGF)系統(tǒng)是一類與胰島素呈高度同源的多肽生長因子，RA可以在不同的細胞系中引起IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ及IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)表達的變化[18]。何伯萍等[19]通過在分離培養(yǎng)的BMECs中添加不同濃度的IGF-Ⅰ作用24 h后發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ能夠顯著促進CSN2和ACACA基因的表達，并且具有濃度依賴性，表明IGF-Ⅰ可作為信號分子調(diào)節(jié)乳腺的泌乳功能。王皓宇等[20]研究發(fā)現(xiàn)，胰島素處理BMECs 24 h可以顯著上調(diào)細胞中CSN2、CSN3、STAT5、ACACA、FASN、SREBP1基因的表達。所以本試驗中維生素A對乳脂、乳蛋白合成相關(guān)基因的影響也可能是通過提高IGF及IGFBP的表達來實現(xiàn)的，需要進一步研究。

本試驗結(jié)果也得出，維生素A對BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達量的影響與其濃度有關(guān)。低濃度的維生素A對BMECs內(nèi)乳蛋白合成的促進效果更好。0.05、0.10 μg/mL維生素A能顯著上調(diào)CSN1S1和mTOR基因表達，0.10、0.20 μg/mL維生素A組則對CSN3、STAT5基因表達的促進作用更好，而2.00 μg/mL維生素A組均與對照組差異不顯著。綜合考慮，0.10 μg/mL維生素A對BMECs內(nèi)乳蛋白合成基因表達的促進作用較好。

4 結(jié) 論

① 維生素A可提高BMECs細胞活力和TG含量。

② 維生素A能上調(diào)BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因FASN、ACACA、PPARG、SREBP1、SCD基因和乳蛋白合成相關(guān)基因CSN1S1、CSN3、STAT5、mTOR基因的表達，但其作用效果與其濃度有關(guān)。

③ 0.10 μg/mL維生素A對乳脂、乳蛋白合成相關(guān)基因表達的促進效果較好。