飼糧中添加葉酸和維生素B12對雛鵝盲腸菌群結構的影響

程漫漫 張廷榮 王寶維 孔 敏 張名愛 岳 斌 葛文華

(青島農業(yè)大學優(yōu)質水禽研究所，國家水禽產業(yè)技術體系營養(yǎng)與飼料功能研究室，青島 266109)

腸道微生物與動物營養(yǎng)代謝、肥胖、脂肪沉積和糖尿病等有密切的關系，腸道微生物在營養(yǎng)代謝方面主要作用于碳水化合物代謝、蛋白質和氨基酸代謝、脂質代謝、維生素代謝及礦物質代謝等[1]。研究表明腸道微生物還與宿主功能關系密切，能夠維持宿主健康、提高生產性能、降低環(huán)境污染以及提高動物產品安全性[2-4]。動物腸道中存在的大量菌群在提高營養(yǎng)物質利用以及維護動物機體健康等方面起了很大的作用。為此，進一步研究腸道菌群結構與營養(yǎng)利用率、生產性能的關系對指導動物飼糧配制具有重要意義。研究表明，葉酸是一種重要的B族維生素，對于維持動物機體健康、正常的生理機能和生產性能具有重要作用，而且是腸道微生物的必需物質，腸道微生物要競爭性的合成和利用一定量的葉酸[5]，而維生素B12作為一碳代謝的輔酶，可以提高葉酸利用率，促進多種DNA合成等[6]。葉酸和維生素B12缺乏除導致白細胞數(shù)量減少外，還可使淋巴細胞功能損害，影響體液免疫，造成中性粒細胞殺菌能力下降[7]。高通量測序技術早已被用來研究家禽腸道微生物多樣性，研究結果表明在雞的盲腸中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為主要優(yōu)勢菌門[8-9]。飼糧中添加葉酸、維生素B12對家禽生產性能影響的研究已有報道[10-12]，但有關不同水平葉酸和維生素B12組合對雛鵝腸道微生物的研究還處于空白。本試驗在飼糧中添加不同水平的葉酸和維生素B12，在研究飼糧中添加葉酸和維生素B12對雛鵝生長性能影響的基礎上，利用16S rRNA高通量測序技術對飼喂添加不同水平葉酸和維生素B12飼糧的雛鵝的盲腸菌群進行分析，比較雛鵝盲腸菌群組成和結構，進一步研究葉酸和維生素B12對雛鵝腸道菌群結構的影響，旨在確定葉酸和維生素B12添加水平與雛鵝盲腸菌群結構的關系，探討提高家禽生長性能的途徑，并為鵝營養(yǎng)需要量標準的制訂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及飼糧組成

葉酸：飼料級，葉酸含量為96%，寧夏金維制藥股份有限公司產品。維生素B12：維生素B12含量為1%，寧夏金維制藥股份有限公司產品。

基礎飼糧以NRC(1994)[13]為主要參考依據(jù)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。采用高效液相色譜法測得基礎飼糧中葉酸含量為0.42 mg/kg，維生素B12含量為0.00 mg/kg。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)多維和微量元素(不含葉酸和維生素B12)為每千克飼糧提供The multivitamin and trace elements (without folic acid and VB12) provided the following per kg of the diet：VA 1 500 mg，VD3200 IU，VE 12.5 mg，VK31.5 mg，VB12.2 mg，VB25.0 mg，煙酸 nicotinic acid 65 mg，VB62 mg，生物素 biotin 0.2 mg，泛酸pantothenate 15 mg，膽堿 choline 1 000 mg，F(xiàn)e 90 mg，Cu 6 mg，Mn 85 mg，Zn 85 mg，I 0.42 mg，Se 0.3 mg，Co 2.5 mg。
2)葉酸和維生素B12為實測值，其他營養(yǎng)水平為計算值。Folic acid and VB12were measured value，while other nutrient levels were calculated values.

1.2 試驗設計

試驗用鵝由國家水禽產業(yè)技術體系育種基地高密銀河潤雁鵝業(yè)有限公司提供。選擇初始體重差異不顯著(P>0.05)的1日齡五龍鵝360只，隨機分為6組，每組6個重復，每個重復10只鵝，公母各占1/2。試驗采用2×3(葉酸×維生素B12)兩因素交叉等重復的析因設計，飼糧中葉酸的添加水平分別為0.55、2.50 mg/kg，維生素B12的添加水平分別為0.009、0.018、0.036 mg/kg，試驗分組見表2。試驗期為4周(1～28日齡)。

表2 試驗分組Table 2 Experiment grouping mg/kg

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗前鵝舍進行徹底全面的消毒，以防止疾病的傳播；采用全期舍飼，地面飼養(yǎng)；試驗鵝自由飲水和采食；少喂勤添；搞好鵝舍內環(huán)境衛(wèi)生，保持地面潔凈干燥，觀察鵝的健康狀況，做好疾病防控工作。

1.4 樣品采集與指標測定

1.4.1 生長性能測定

飼養(yǎng)試驗結束后停飼6 h，然后逐只空腹稱重，統(tǒng)計各組試驗鵝的體重和增重情況，計算終末體重(FBW)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)

1.4.2 盲腸菌群結構測定

1.4.2.1 盲腸樣品的采集

空腹稱重后，各重復隨機選擇2只鵝，公母各占1/2，頸靜脈放血致死后迅速剖開腹腔，無菌操作取出盲腸，迅速收集到凍存管中液氮保存，然后轉移到-80 ℃冰箱保存待測。

1.4.2.2 盲腸細菌總DNA的提取

對每個樣品進行單獨測定，采用天根生化科技有限公司的基因組DNA試劑盒提取出盲腸細菌總DNA。

1.4.2.3 盲腸細菌總DNA的定量和純度檢測

總DNA含量用DNA定量儀進行測定，DNA純度用OD260/OD280進行表述，同時用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小。

1.4.2.4 PCR擴增及細菌16S rRNA測序分析

按照細菌16S rRNA(V3+V4)區(qū)域合成引物：上游引物，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物，5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。樣品檢測時PCR預試驗的程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共25個循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 17.0軟件中一般線性模型(GLM)分析主效應和互作，再用ANOVA和LSD法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。將優(yōu)化序列進行聚類，劃分操作分類單位(OTU)，基于OTU分析結果，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析，獲得各樣品在門、屬、種分類學水平上的菌群結構圖、物種豐度聚類熱圖等。

2 結果與分析

2.1 飼糧中添加葉酸和維生素B12對雛鵝生長性能的影響

飼糧中添加葉酸和維生素B12水平對雛鵝終末體重、平均日增重和料重比的影響見表3。飼糧中添加不同水平的葉酸對雛鵝終末體重、平均日增重和料重比的影響均不顯著(P>0.05)。飼糧中添加不同水平的維生素B12對雛鵝終末體重、平均日增重的影響顯著(P<0.05)，對料重比的影響不顯著(P>0.05)。葉酸和維生素B12的交互作用對雛鵝終末體重、平均日增重的影響顯著(P<0.05)，對料重比的影響不顯著(P>0.05)。其中，Ⅳ組的終末體重和平均日增重顯著高于其他5組(P<0.05)，表明飼糧中添加2.50 mg/kg葉酸和0.009 mg/kg維生素B12時雛鵝的生長性能最佳。

2.2 飼糧中添加葉酸和維生素B12對雛鵝盲腸菌群結構的影響

2.2.1 菌群α多樣性分析結果

由表4可知，飼糧中添加不同水平的葉酸和維生素B12組合使雛鵝盲腸微生物的豐度和多樣性發(fā)生了改變。Ⅳ組的OUT數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)最高，表明Ⅳ組盲腸微生物的物種豐度高于其他5個組；Ⅴ組的Shannon指數(shù)最高，Simpson指數(shù)最小，表明Ⅴ組的群落多樣性最高，個體分配最均勻。另外，本試驗還統(tǒng)計了反映OUT測序深度的指數(shù)覆蓋度(coverage)，6組樣本的coverage值均大于0.999，表明樣本中物種被測出的概率很高。

表3 飼糧中添加葉酸和維生素B12對雛鵝生長性能的影響Table 3 Effects of folic acid and VB12 supplementations on growth performance of gosling

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。ns=差異不顯著。
In the same row, values with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). ns= not significant.

表4 α多樣性指數(shù)Table 4 α diversity indices

Shannon曲線是利用各樣本的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構建的曲線，以此來反映各樣本在不同測序量時的微生物多樣性。由圖1可知，起初曲線直線上升，隨后緩慢升高直至平滑，6組樣本均表現(xiàn)出先驟增后趨于某一個定值的趨勢，由此表明，6組樣本的測序量都足以覆蓋樣本中絕大部分微生物。

由圖2可知，本試驗樣本組成的紅色箱式曲線先緩慢升高后趨于平緩，表明物種不隨樣本量的增加而顯著增多；綠色箱式曲線先下降后趨于平緩，表明所取樣本中的共有物種趨于飽和。紅色和綠色箱式曲線結果均說明本試驗所取樣本量足以反映當前所有微生物物種。

2.2.2 菌群相似性分析結果

通過分析不同組樣本OUT的組成可以反映樣品的差異和距離。采用非加權組平均(UPGMA)法對樣本進行聚類分析。距離標尺下，由樣本UPGMA聚類樹(圖3)可知，Ⅰ組與Ⅵ組距離最小，說明Ⅰ組與Ⅵ組盲腸菌群組成相似性最高；Ⅰ組與Ⅱ組距離最大，說明Ⅰ組與Ⅱ組盲腸菌群組成相似性最低。這說明飼糧中添加不同水平的葉酸和維生素B12對雛鵝盲腸菌群結構產生了一定的影響。圖4所示的組間主坐標分析(PCoA)結果與該結果相似。

D1：Ⅰ組；D2：Ⅱ組；D3：Ⅲ組；D4：Ⅳ組；D5：Ⅴ組；D6：Ⅵ組。下圖同。
D1: group Ⅰ; D2: group Ⅱ; D3: group Ⅲ; D4: group Ⅳ; D5: group Ⅴ; D6: group Ⅵ. The same as below.
圖1Shannon曲線
Fig.1 Shannon curve

圖2 屬水平物種累積曲線圖Fig.2 Cumulative curve chart of species in genus level

圖3 UPGMA聚類樹Fig.3 UPGMA clustering tree

圖4 PCoA圖Fig.4 PCoA chart

圖5為雛鵝盲腸菌群屬水平物種豐度聚類熱圖。由圖可知，Ⅱ組與Ⅳ組顏色差異最大，分支距離也最遠，表明Ⅱ組與Ⅳ組在屬水平上菌群相似性最低；Ⅰ組與Ⅲ組、Ⅵ組顏色差異均較小，距離較近，表明Ⅰ組與Ⅲ組、Ⅵ組在屬水平上菌群相似性均較高；Ⅱ組與Ⅴ組顏色差異最小，距離最近，表明Ⅱ組與Ⅴ組在屬水平上菌群相似性最高；Ⅲ組與Ⅳ組顏色差異最小，距離最近，表明Ⅲ組與Ⅳ組在屬水平上菌群相似性最高。上述結果說明飼糧中添加不同水平的葉酸和維生素B12使雛鵝盲腸菌群結構發(fā)生了變化。

2.2.3 優(yōu)勢菌群分析

圖6顯示的是飼糧添加不同水平的葉酸和維生素B12對雛鵝盲腸菌群門水平豐度的影響。在相似性97%的門水平下，所有盲腸樣本中檢測到10個菌門，其中Ⅵ組、Ⅴ組、Ⅳ組均檢測出9個菌門，Ⅲ組、Ⅱ組分別檢測到8和7個菌門。分別計算盲腸樣本中檢測到的菌門的相對豐度，可知厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌門。圖7顯示的是優(yōu)勢菌門的相對豐度，Ⅱ組厚壁菌門相對豐度最高，為61.5%，顯著高于其他各組(P<0.05)；Ⅵ組擬桿菌門相對豐度最高，為38.4%，與Ⅲ組、Ⅴ組差異不顯著(P>0.05)；Ⅰ組變形菌門相對豐度最高，為37.7%，顯著高于Ⅱ組、Ⅴ組(P<0.05)。此外，藍藻菌門(Cyanobacteria)在Ⅳ組的相對豐度最高，為1.89%，疣微菌門(Verrucomicrobia)在Ⅵ組的相對豐度最高，為3.1%，無壁菌門(Tenericutes)在Ⅴ組的相對豐度最高，為2.7%。其他菌門如放線菌門(Actinobacteria)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)相對豐度較低(<0.1%)，甚至在有些樣本中未檢測到。飼糧添加不同水平的葉酸和維生素B12使雛鵝盲腸菌群門水平豐度發(fā)生了變化，其中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門變化明顯，這說明，飼糧中添加不同水平葉酸和維生素B12改變了雛鵝盲腸菌群結構。

圖8顯示了飼糧添加不同水平的葉酸和維生素B12對雛鵝盲腸菌群屬水平豐度的影響。所有盲腸樣本中共檢測到91個菌屬，Ⅰ～Ⅵ組分別檢測到86、84、83、87、87、83個菌屬。如圖8所示，相對豐度較高的5個屬分別為脫磷弧菌屬(Desulfovibrio)、桿菌屬(Bacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、另枝菌屬(Alistipes)和巴那斯拉菌屬(Barnesiella)。如圖9所示，相對豐度排名前5的優(yōu)勢菌屬的相對豐度在不同組之間存在較大差異。脫磷弧菌屬在Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅳ組中相對豐度較高，與另外3組差異顯著(P<0.05)；Ⅳ組的桿菌屬相對豐度最高，顯著高于其他5組(P<0.05)；Ⅴ組的擬桿菌屬相對豐度最高，顯著高于Ⅰ組、Ⅲ組和Ⅳ組(P<0.05)；Ⅵ組的另枝菌屬相對豐度最高，顯著高于除Ⅲ組外的其余各組(P<0.05)；Ⅲ組的巴那斯拉菌屬相對豐度最高，顯著高于其他5組(P<0.05)。

圖5 屬水平物種豐度聚類熱圖Fig.5 Species abundance clustering heat map in genus level

圖10顯示了飼糧中添加不同水平的葉酸和維生素B12對雛鵝盲腸菌群種水平豐度的影響。如圖11所示，在種水平，6組樣本中，桿菌(Bacillus)在Ⅰ～Ⅵ組中的相對豐度分別為93.5%、93.7%、87.8%、95.2%、93.4%和87.9%，表明桿菌在雛鵝盲腸種水平上有絕對優(yōu)勢。飼糧中添加不同水平葉酸和維生素B12組合對雛鵝盲腸中其他菌種相對豐度的影響均未達到顯著水平(P>0.05)。

3 討 論

3.1 葉酸和維生素B12的功能與相互關系

腸道微生物既影響著營養(yǎng)物質的消化、吸收和能量供應，又調控著宿主正常生理功能及疾病的發(fā)生與發(fā)展，腸道微生態(tài)系統(tǒng)對機體正常功能的運行有著至關重要的影響[14]。目前，關于用高通量測序來測定家禽腸道菌群的研究早有報道。研究表明，腸道微生物及其代謝對肉仔雞的營養(yǎng)、健康與疾病具有重要的影響和調控作用，通過營養(yǎng)方式干預宿主腸道微生物健康已經成為動物營養(yǎng)學研究的熱點[10]。研究表明，在玉米-豆粕型肉仔雞飼糧中添加葉酸，可提高采食量和體重且以3.0 mg/kg葉酸組的效果最顯著[11]。薛安永等[12]發(fā)現(xiàn)，在8周齡肉雜雞飼糧中添加葉酸，日采食量和日增重在含有1.64 mg/kg葉酸組與其他各組間存在顯著差異；與對照組比較，日增重和日采食量在葉酸添加組有增加的趨勢。余有貴[15]研究表明，葉酸具有維持動物免疫系統(tǒng)正常功能的作用，其缺乏會提高動物對細菌的敏感性，阻礙淋巴細胞正常功能的發(fā)揮及抗體的合成。

Unknown：未知菌；Others：其他；Actinobacteria：放線菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Lentisphaerae：黏膠球形菌門；Tenericutes:無壁菌門；Verrucomicrobia:疣微菌門；Cyanobacteria:藍藻菌門；Proteobacteria:變形菌門；Bacteroidetes:擬桿菌門；Firmicutes:厚壁菌門。
圖6門水平物種分布柱狀圖
Fig.6 Distribution histogram of species in phylum level

Firmicutes:厚壁菌門；Bacteroidetes:擬桿菌門；Proteobacteria:變形菌門；Cyanobacteria:藍藻菌門；Verrucomicrobia:疣微菌門。
數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖9和圖11同。
Data columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.9 and Fig.11.
圖7各組門水平優(yōu)勢菌結構與分布
Fig.7 Structure and distribution of dominant microorganisms in phylum level of each group

Unknown：未知菌；Others：其他；Anaerotruncus:厭氧棍狀菌屬；Parabacteroides:副類桿菌屬；Phascolarctobacterium:考拉桿菌屬；Faecalibacterium:柔嫩梭菌屬；Ruminococcaceae UCG-014:瘤胃球科菌UCG-014菌屬；Barnesiella:巴那斯拉菌屬；Alistipes:另枝菌屬；Bacteroides:擬桿菌屬；Bacterium:桿菌屬；Desulfovibrio:脫磷弧菌屬。
圖8屬水平物種分布柱狀圖
Fig.8 Distribution histogram of species in genus level

Desulfovibrio:脫磷弧菌屬；Bacterium:桿菌屬；Bacteroides:擬桿菌屬；Alistipes:另枝菌屬；Barnesiella:巴那斯拉菌屬。
圖9各組屬水平優(yōu)勢菌結構與分布
Fig.9 Structure and distribution of dominant microorganisms in genus level of each group

維生素B12作為輔酶，參與一碳單位的合成，在DNA甲基化中起著非常重要的作用。維生素B12影響著葉酸的代謝效率，并且參與嘌呤和核苷酸的合成，同時維持DNA的合成與修復，保證染色體的穩(wěn)定性。維生素B12在機體內主要通過2種物質吸收和轉運，分別是內源因子(intrisic factor,IF)和鈷胺轉運蛋白(transcobalamin，TC)。所以，維生素B12實際上與核酸和蛋白質的合成密切相關[16]。維生素B12依賴的是蛋氨酸合成酶，能催化1個甲基基團,從甲基四氫葉酸上轉移至同型半胱氨酸(Hcy)，形成蛋氨酸，最終形成S腺苷蛋氨酸(SAM)。缺乏維生素B12將減少DNA甲基化的SAM可利用量，從而影響其基因的表達[17]。葉酸與維生素B12聯(lián)合應用的研究常見于醫(yī)學報道，而在家禽營養(yǎng)學上的研究基本處于空白。本試驗首次利用高通量測序技術研究飼糧中聯(lián)合添加不同水平的葉酸和維生素B12對雛鵝盲腸菌群結構的影響，以探討不同添加水平葉酸和維生素B12的組合效應對盲腸菌群結構的干預效果。本試驗中Ⅳ組(葉酸添加水平2.50 mg/kg×維生素B12添加水平0.009 mg/kg)的OUT數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均最高，表明Ⅳ組盲腸微生物的物種豐度高于其他5組，飼糧中添加不同水平的葉酸和維生素B12能夠影響雛鵝盲腸菌群組成和數(shù)量。

Unknow：未知菌；Alpha_proteobacterium:α-變形菌；Rumen_bacterium：瘤胃細菌；Lachnospiraceae_bacterium：毛螺菌科細菌；Organism：組織有機體；Bacillus：桿菌。圖11同 The same as Fig.11。
圖10種水平物種分布柱狀圖
Fig.10 Distribution histogram of species in species level

3.2 飼糧中添加葉酸和維生素B12對雛鵝盲腸菌群結構的影響

研究證明，厚壁菌門與腸道吸收營養(yǎng)息息相關，肥胖人體內厚壁菌門一般維持一個較高的比例，且菌群多樣性程度較差，同時厚壁菌門細菌種類的比例增加可能有助于肥胖的病理生理學，肥胖的嚴重程度往往與厚壁菌門占比呈正相關[18]。厚壁菌門主要功能是對碳水化合物和蛋白質進行水解，而擬桿菌門主要作用于類固醇、多糖和膽汁酸的代謝，有助于宿主對多糖的吸收以及蛋白質的合成[19]。Hildebrandt等[20]在對RELⅡ基因敲除小鼠和野生鼠從正常飲食切換到高脂肪飲食后發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門的數(shù)量有所減少而厚壁菌門和變形菌門的數(shù)量有所增加，作者推測這種變化是由高脂肪飲食引起而不是肥胖本身所引起。本試驗在所有雛鵝盲腸樣本中共檢測到10個菌門，其中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門，這與之前的報道[21]結果一致。各組盲腸樣本在門、屬水平上的菌群分布均存在差異。在門水平上，Ⅱ組厚壁菌門的相對豐度最高，Ⅵ組擬桿菌門的相對豐度最高，Ⅰ組變形菌門的相對豐度最高。在屬水平上，相對豐度最高的5個屬分別為脫磷弧菌屬、桿菌屬、擬桿菌屬、另枝菌屬和巴那斯拉菌屬，且優(yōu)勢菌屬的相對豐度在不同組之間存在較大差異，在種水平上，6組鵝盲腸樣本中桿菌均有絕對優(yōu)勢，但組間差異不顯著。這表明飼糧中添加不同水平的葉酸和維生素B12影響了雛鵝盲腸的菌群結構。結合生長性能結果，飼糧中添加2.50 mg/kg葉酸和0.009 mg/kg維生素B12的組雛鵝的終末體重和平均日增重最高，進一步表明飼糧中葉酸和維生素B12組合通過調節(jié)雛鵝盲腸菌群結構影響其生長性能。

圖11 各組種水平優(yōu)勢菌結構與分布Fig.11 Structure and distribution of dominant microorganisms in species level of each group

4 結 論

① 飼糧中添加2.50 mg/kg葉酸和0.009 mg/kg維生素B12的組雛鵝的終末體重和平均日增重最高。

② 飼糧中添加2.50 mg/kg葉酸和0.009 mg/kg維生素B12的盲腸菌群OUT數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)最高，物種豐度最高。

③ 盲腸優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬的相對豐度在不同組之間存在較大差異，但桿菌在各組雛鵝盲腸中均占有絕對優(yōu)勢。

④ 由此得出，飼糧中添加2.50 mg/kg葉酸和0.009 mg/kg維生素B12能夠優(yōu)化雛鵝盲腸菌群結構，增加有益菌的豐度，進而提高生長性能。