氧化應(yīng)激對(duì)豬腸道損傷機(jī)制的研究進(jìn)展

陳鳳鳴 陳佳億 彭 偉 韋良開(kāi) 李穎慧 黃興國(guó)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

機(jī)體氧化還原反應(yīng)是許多生物化學(xué)反應(yīng)途徑以及細(xì)胞功能的基礎(chǔ)[1]，其穩(wěn)態(tài)的維持主要是依賴于機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡，活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過(guò)量或者機(jī)體抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，就會(huì)打破這種動(dòng)態(tài)平衡，引起氧化應(yīng)激(oxidative stress，OX)[2]。ROS過(guò)量產(chǎn)生或抗氧化劑系統(tǒng)清除ROS不足都會(huì)引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腸道細(xì)胞凋亡和組織損傷[3]。腸道黏膜屏障遭到破壞將會(huì)迅速激活先天性免疫，引起固有層急性炎癥反應(yīng)，一旦腸道黏膜屏障被破壞，免疫細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞與致病因子發(fā)生反應(yīng)，并產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和ROS，進(jìn)而破壞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)[4]，最終導(dǎo)致破壞腸上皮細(xì)胞層凋亡途徑的激活。目前有關(guān)ROS在細(xì)胞中的作用都是針對(duì)一定水平范圍而言的，低水平的ROS促進(jìn)細(xì)胞有益反應(yīng)，高水平的ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷和死亡。然而，不同的ROS產(chǎn)生系統(tǒng)也可能導(dǎo)致不同的響應(yīng)。例如，在線粒體中產(chǎn)生的ROS更容易引起細(xì)胞損傷和凋亡[5-6]，而在膜上產(chǎn)生的ROS更有助于細(xì)胞增殖分化的信號(hào)傳導(dǎo)[7]。當(dāng)然，這樣區(qū)別也不是絕對(duì)的，線粒體產(chǎn)生的ROS也被證明對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移有積極作用[8-9]，而還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶產(chǎn)生的ROS也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。ROS在生理水平范圍內(nèi)參與許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白激酶活化等，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的協(xié)調(diào)[11]。因此，ROS的兩面性增加了使用抗氧化劑用量的難度。

1 腸道ROS產(chǎn)生的來(lái)源

動(dòng)物腸道自由基按照來(lái)源可分為內(nèi)源性自由基和外源性自由基。內(nèi)源性自由基主要來(lái)源于線粒體呼吸鏈(mETC)、NADPH氧化酶及黃嘌呤氧化酶等氧化酶酶促反應(yīng)途徑；腸道中的過(guò)渡金屬離子通過(guò)芬頓反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生自由基；腸道共生菌也會(huì)誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生自由基；此外，機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞和過(guò)氧化物酶也會(huì)產(chǎn)生自由基。環(huán)境因素(高溫、低溫、過(guò)高的飼養(yǎng)密度等)、疾病因素(細(xì)菌或病毒感染、寄生蟲(chóng)球蟲(chóng)等)、飼糧因素(不飽和脂肪的氧化、霉菌毒素等)等因素導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生外源性自由基，形成氧化損傷。

1.1 mETC和NADPH氧化酶酶促反應(yīng)

1.2 其他氧化酶酶促反應(yīng)

1.3 過(guò)渡金屬芬頓反應(yīng)

氧化還原活性金屬(如鐵、銅、鉻、鈷等)可能參與金屬與底物之間電子轉(zhuǎn)移的循環(huán)反應(yīng)，因此在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)中起重要作用，這種現(xiàn)象與金屬穩(wěn)態(tài)緊密相關(guān)[22]。金屬穩(wěn)態(tài)的破壞可能導(dǎo)致自由基參與DNA堿基修飾形成，增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化以及改變巰基穩(wěn)態(tài)[23]。腸道中的過(guò)渡金屬離子進(jìn)行芬頓反應(yīng)將會(huì)加速脂質(zhì)的過(guò)氧化[24]。

1.4 共生細(xì)菌誘導(dǎo)

動(dòng)物腸道微生物群可為宿主提供能量、刺激機(jī)體免疫應(yīng)答和競(jìng)爭(zhēng)性排除病原微生物等[25]，這些功能的實(shí)現(xiàn)依靠宿主細(xì)胞與腸道微生物之間的“模式識(shí)別受體”(PRR)。PRR是由“微生物相關(guān)分子模式”(microbe-associated molecular patterns，MAMP)的基序結(jié)合的Toll樣受體(TLR)和相關(guān)的Nod樣受體(NLR)組成。PRR是腸道抵御感染的第1道防線，活化一系列信號(hào)通路，引發(fā)天然免疫反應(yīng)，維持腸道動(dòng)態(tài)平衡，成為固有免疫應(yīng)答的樞紐[26]。腸道共生菌(如乳桿菌屬)正是通過(guò)激活PRR，刺激腸上皮細(xì)胞NOX1產(chǎn)生非致病水平的ROS，從而刺激腸道干細(xì)胞的增殖分化；另外，ROS通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路，誘導(dǎo)一系列抗氧化基因的上調(diào)[27]。Kumar等[28]在體外將腸道上皮細(xì)胞與共生菌培養(yǎng)以及在體內(nèi)給予小鼠鼠李糖乳桿菌，發(fā)現(xiàn)乳桿菌均能夠刺激腸上皮細(xì)胞快速產(chǎn)生ROS。然而，盡管共生細(xì)菌誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS，但是產(chǎn)生的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

2 氧化應(yīng)激對(duì)腸上皮細(xì)胞的影響

腸道黏膜是一個(gè)復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的組織，由表面單層自我更新上皮細(xì)胞和底層的固有免疫層、血管和其他結(jié)構(gòu)成分構(gòu)成[29]。腸道黏膜逐漸進(jìn)化出了既能消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分，同時(shí)又能保護(hù)機(jī)體免受腸道內(nèi)有毒物質(zhì)傷害的功能。這種保護(hù)作用是基于腸上皮細(xì)胞持續(xù)地能夠自下而上的垂直遷移、分化直至頂端調(diào)亡，最后掉入腸腔的生理周期。而腸道的這種更新和穩(wěn)態(tài)是由隱窩腸道干細(xì)胞(intestinal stem cells，ISCs)維持的，ISCs產(chǎn)生了一系列高度增殖的祖細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)運(yùn)放大細(xì)胞(TA)，這些細(xì)胞進(jìn)行幾輪細(xì)胞分裂，并在腸道分化向上遷移至絨毛，完成組織的消化和吸收相關(guān)功能，通常3～7 d完成一次腸道細(xì)胞更新[30]。

絨毛中的4種分化細(xì)胞中多數(shù)為吸收型腸細(xì)胞(占所有上皮細(xì)胞的80%)，其他為分泌型細(xì)胞：杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和簇絨細(xì)胞。ISCs主要在隱窩中，目前已經(jīng)鑒定出2種類型的干細(xì)胞，分別是位于隱窩中的放射敏感多功能干細(xì)胞和位于隱窩基底的柱狀細(xì)胞(crypt base columnar，CBC)[31]。潘氏細(xì)胞是隱窩中唯一分化的細(xì)胞，分泌多種殺菌產(chǎn)物，如溶菌酶、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等，不僅起到天然免疫和抗菌防御的作用，而且還為腸道干細(xì)胞提供必要的信號(hào)傳導(dǎo)[32]?？刂艻SCs自我更新、細(xì)胞增殖、遷移和分化的信號(hào)機(jī)制尚不完全清楚，其中主要的可能機(jī)制是通過(guò)Wnt/β-鏈蛋白(β-catenin)、Notch、磷酸酶和張力蛋白同源等位基因(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號(hào)通路。其中，Wnt/β-catenin、PTEN/PI3K/Akt和Notch信號(hào)通路對(duì)氧化應(yīng)激極為敏感，因?yàn)樗鼈兪艿絅ADPH氧化酶調(diào)節(jié)。

2.1 Wnt/β-catenin、PTEN/PI3K/Akt、Notch信號(hào)通路

NOX1和雙氧化酶2(Duox2)是NADPH氧化酶家族成員，在腸上皮細(xì)胞中高度表達(dá)[33]，NOX1對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖、遷移有直接作用[34]。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的主要參與者之一[35]，在體內(nèi)和體外進(jìn)行的大量研究已經(jīng)證明Wnt途徑在維持干細(xì)胞增殖和多能性方面起到重要作用[36]。Wnt信號(hào)的失活是由β-catenin的N-末端磷酸化觸發(fā)，隨后被蛋白酶體降解。而β-catenin的磷酸化狀態(tài)是由腫瘤抑制蛋白腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、酪氨酸激酶Ⅰ和Axin組成的降解復(fù)合物決定[31]。當(dāng)Wnt蛋白和它的特異性受體卷曲蛋白-低密度脂蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合受體(Frizzled/LRP)結(jié)合時(shí)，降解復(fù)合物失活，引發(fā)了β-catenin的積聚并且其轉(zhuǎn)位至核，在核內(nèi)它與T細(xì)胞因子(TCF)的轉(zhuǎn)錄因子形成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(TCF/LEF)上調(diào)靶基因，如c-MYC蛋白和促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞B(EPHB)[31]。PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路中PTEN是通過(guò)將PI3P去磷酸化為PIP2實(shí)現(xiàn)對(duì)PI3K的負(fù)性調(diào)節(jié)的。在磷脂酰肌醇依賴性激酶1、2(PDK1、PDK2)的作用下，活化的PI3K與Akt結(jié)合，使其磷酸化而被激活[37]。PI3K通路可以輔助Wnt信號(hào)通路，通過(guò)作用于β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，加強(qiáng)腸道干細(xì)胞的自我更新[38]。

小腸上皮的成熟細(xì)胞分為吸收型和分泌型，Notch信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)分化成吸收型細(xì)胞譜系而不是分泌型細(xì)胞譜系[39]，另外，Notch靶向不同的祖細(xì)胞群維持腸道干細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化方向，以控制腸上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[40]。Notch是一種受體蛋白，它和Notch的配體(Jagged/Delta)均是膜結(jié)合蛋白，當(dāng)兩者相互結(jié)合時(shí)，觸發(fā)γ-分泌蛋白酶復(fù)合物對(duì)受體蛋白水解切割，Notch信號(hào)就被激活[41]。切割釋放游離的Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域NICD(Notch intracellular domain，NICD)，該結(jié)構(gòu)域移位到核中與轉(zhuǎn)錄因子重組信號(hào)結(jié)合蛋白J-k(RBPJ-k)結(jié)合，從而上調(diào)靶基因的表達(dá)。前體細(xì)胞向腸上皮細(xì)胞的分化部分是由轉(zhuǎn)錄因子Hes1決定的，而分泌前體分化成杯狀細(xì)胞或腸內(nèi)分泌細(xì)胞是由Math1或神經(jīng)元素3調(diào)節(jié)的，它們都是Notch信號(hào)的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。

2.2 NADPH氧化酶介導(dǎo)ROS對(duì)Wnt/β-catenin、PTEN/PI3K/Akt、Notch信號(hào)通路的影響

NOX1對(duì)于結(jié)腸上皮細(xì)胞的Wnt/β-catenin和Notch信號(hào)通路的調(diào)控有著重要的作用。核因子-κB(NF-κB)是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，在ROS高水平時(shí)被激活，而水解切割釋放Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域NICD的γ-分泌蛋白酶復(fù)合物受到NF-κB調(diào)控。在敲除小鼠NOX1基因的試驗(yàn)中，通過(guò)降低Notch信號(hào)通路中γ-分泌蛋白酶復(fù)合物的水平，減少NICD的釋放，從而導(dǎo)致Hes1基因表達(dá)下調(diào)和Math1基因表達(dá)上調(diào)[42]。使用γ-分泌蛋白酶抑制劑來(lái)阻斷Notch信號(hào)通路導(dǎo)致所有腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為杯狀細(xì)胞[43]。另外，NOX1產(chǎn)生的ROS通過(guò)間接氧化PTEN，從而抑制PI3K活化，影響β-catenin的轉(zhuǎn)錄。在由H2O2誘導(dǎo)的大鼠上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中發(fā)現(xiàn)，ROS通過(guò)PTEN信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[44]。此外，結(jié)腸缺陷NOX1基因的小鼠通過(guò)抑制Wnt/β-catenin和Notch信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖顯著減少，祖細(xì)胞中的細(xì)胞周期停滯，以及所有祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為杯狀細(xì)胞[42]。大量的研究表明Wnt/β-catenin、PTEN/PI3K/Akt和Notch信號(hào)通路之間的分層調(diào)節(jié)作用于腸道細(xì)胞的增殖和分化[45-46]。

TP53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡的調(diào)控子(TIGAR)通過(guò)產(chǎn)生還原型谷胱甘肽來(lái)增加NADPH的產(chǎn)生和抗氧化活性[47]。有氧氧化與糖酵解合成的ATP的相互比例與TP53基因表達(dá)成反比，因此TP53基因的丟失導(dǎo)致氧消耗增加和有氧呼吸減少，促進(jìn)轉(zhuǎn)向糖酵解，使細(xì)胞由于ROS水平的升高而引起凋亡。另外，TIGAR基因缺失小鼠由于ROS的增加和核苷酸合成減少，影響了腸道細(xì)胞的增殖[48]。因此，TIGAR能夠通過(guò)控制ROS起到提供抗氧化防御的作用[49]。RAC1是NADPH氧化酶信號(hào)復(fù)合物的組分，影響多種信號(hào)通路，包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、NF-κB和ROS的產(chǎn)生[50]。與TIGAR基因的缺失表現(xiàn)相類似，RAC1基因的缺失也導(dǎo)致腸道Wnt依賴性細(xì)胞增殖障礙，但是不同的是這種作用是通過(guò)降低ROS水平引起的[51]。這引起了一個(gè)悖論，即腸道中ROS的減少和增加都可能導(dǎo)致腸道細(xì)胞的增殖減少。除此之外，脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE1)是對(duì)氧化應(yīng)激起主要反應(yīng)的因子，在腸道上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，調(diào)節(jié)多種細(xì)菌感染反應(yīng)，包括趨化因子的產(chǎn)生、細(xì)胞增殖和凋亡等。APE1可以通過(guò)調(diào)節(jié)RAC1介導(dǎo)的NADPH氧化酶抑制腸上皮細(xì)胞胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。APE1的羧基端負(fù)責(zé)修復(fù)ROS誘導(dǎo)的DNA損傷，氮端主要參與氧化還原介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄共刺激作用[13]。

3 氧化應(yīng)激對(duì)動(dòng)物腸道健康的影響

動(dòng)物生產(chǎn)中，有很多因素都會(huì)導(dǎo)致ROS蓄積，造成機(jī)體氧化應(yīng)激，如溫度應(yīng)激、斷奶應(yīng)激、飼養(yǎng)密度、飼料中霉菌毒素及氧化油脂等因素。氧化應(yīng)激與許多綜合征有關(guān)，其中腸道的氧化損傷極易發(fā)生，且危害大。消化道是消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能器官，它還具有免疫、內(nèi)分泌、黏膜屏障等作用。胃腸道的結(jié)構(gòu)、整體性、氧化還原狀態(tài)、微生物菌群和酶系的平衡狀態(tài)是保證其正常生理功能的重要因素。腸上皮細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是腸道黏膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腸上皮細(xì)胞組織穩(wěn)定的必要條件，腸上皮細(xì)胞凋亡異常會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜屏障損傷和胃腸功能紊亂[52]。在豬的生產(chǎn)中，由于飼糧和環(huán)境的巨大變化，斷奶是仔豬的關(guān)鍵過(guò)程。斷奶應(yīng)激引起的明顯腸道形態(tài)變化是絨毛脫落、絨毛縮短和隱窩增生[53]。Zhu等[54]通過(guò)對(duì)12窩96頭仔豬斷奶進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)斷奶應(yīng)激顯著降低絨毛高度和增加隱窩深度，且斷奶應(yīng)激造成仔豬腸道屏障功能喪失，促進(jìn)自由基生成，抑制抗氧化效應(yīng)，降低消化酶活性。細(xì)胞凋亡主要有2種途徑：內(nèi)源性(線粒體依賴性細(xì)胞凋亡)和外源性(Fas依賴性細(xì)胞凋亡)途徑。內(nèi)源性途徑是由線粒體介導(dǎo)，主要以半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的激活為特征[55]，而外源性途徑涉及半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)，后者通過(guò)激活膜凋亡受體如Fas而激活[56]。這2種途徑都匯聚到凋亡的共同執(zhí)行階段，都需要蛋白質(zhì)水解激活半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)，引發(fā)半胱氨酸蛋白酶活化[57]。Zhu等[58]研究報(bào)道，由于斷奶應(yīng)激增強(qiáng)自由基生成，造成Fas、Caspase-3和Caspase-9基因表達(dá)均顯著增加，表明斷奶造成的應(yīng)激通過(guò)激活內(nèi)源性和外源性凋亡途徑增加斷奶仔豬腸上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡。因此，氧化應(yīng)激不僅引發(fā)腸道黏膜細(xì)胞損傷，繼而導(dǎo)致消化道分泌吸收功能下降，還可通過(guò)ROS介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響細(xì)胞的增殖分化和凋亡等過(guò)程。

4 小 結(jié)

在豬生產(chǎn)中，當(dāng)豬只遭受應(yīng)激刺激或患病時(shí)，機(jī)體代謝出現(xiàn)異常而驟然產(chǎn)生大量ROS，而ROS在細(xì)胞中的水平?jīng)Q定了其可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞的凋亡，同時(shí)也決定了先天免疫反應(yīng)。腸道時(shí)刻與外界相通，接觸外界微生物次數(shù)也是最多。因此，當(dāng)ROS積累過(guò)多時(shí)，機(jī)體的氧化還原平衡對(duì)及抗氧化酶組成的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致腸道黏膜的氧化還原平衡失衡，進(jìn)而造成疾病的發(fā)生。因此，ROS的兩面性使得抗氧化劑的用量變得困難。今后，應(yīng)充分地認(rèn)識(shí)和關(guān)注氧化應(yīng)激發(fā)生的原因和機(jī)理，深入研究自由基的種類和水平對(duì)動(dòng)物腸道損傷的影響，并且針對(duì)不同的氧化應(yīng)激類型，在動(dòng)物生產(chǎn)中合理使用抗氧化劑。