基于TaqMan實(shí)時熒光PCR檢測鮮肉及加工肉制品中的驢源性成分

海小 劉國強(qiáng) 羅建興 郭梁

摘 要：根據(jù)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3730.4—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測 實(shí)時熒光PCR法》合成引物和探針，利用TaqMan實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測鮮肉及加工肉制品中的驢源性成分。首先對13 種不同動物鮮肉組織的DNA進(jìn)行驢源性成分特異性檢測，然后對驢源性DNA模板原液進(jìn)行梯度稀釋，檢測方法靈敏度，最后在加工肉制品中檢測方法的適用性。結(jié)果表明：本研究建立的方法特異性強(qiáng)，除驢肉外，牛、羊、豬、馬、駱駝、鹿、狗、兔、雞、鴨、鴿子、鵪鶉12 種動物鮮肉組織均無特異性擴(kuò)增；方法的靈敏度較高，驢組分DNA的檢出限可達(dá)100 fg/μL，靈敏度可達(dá)0.01%；方法的適用性較廣，可以用于加工肉制品中驢源性成分的檢測。

關(guān)鍵詞：TaqMan實(shí)時熒光PCR技術(shù)；鮮肉及加工肉制品；驢源性成分；特異性；靈敏度

Abstract： In this study， we synthesized a set of primers and TaqMan probe according to the industry standard （SN/T 3730.4—2013） for the detection of donkey-derived ingredients in raw and processed meats by real-time fluorescence polymerase chain reaction （PCR）. The specificity of the primers and probe were tested using DNA templates extracted from raw meats from donkey and 12 other animal species. Gradient dilutions of the donkey-derived DNA template were used to evaluate the sensitivity. The applicability of the PCR assay for processed meat was also investigated. The results showed that this PCR assay was highly specific and could specifically amplify DNA from donkey rather than cattle， sheep， pig， horse， camel， deer， dog， rabbit， chicken， duck， pigeon and quail. It was sensitive. The limit of detection for donkey DNA was 100 fg/μL and the sensitivity was 0.01%. This method was widely applicable and useful for the detection of donkey-derived ingredients in processed meat.

Keywords： TaqMan real-time polymerase chain reaction； raw and processed meats； donkey-derived ingredients； specificity； sensitivity

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201804011

中圖分類號：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）04-0062-06

肉類是人類膳食的重要組成部分，肉中富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、碳水化合物、脂肪和維生素等，這些成分對人類健康至關(guān)重要[1]。由于豐富的營養(yǎng)價值以及日益增長的生產(chǎn)量和消費(fèi)量，肉類成為食品加工和流通領(lǐng)域中摻假事件的主要目標(biāo)，一些不法商販和企業(yè)在牛肉、羊肉、鹿肉等高價肉制品中摻雜雞肉、鴨肉等低價原料肉，將低價肉或非肉成分經(jīng)香精處理后冒充高價肉，這種“摻雜使假”行為對人類健康、消費(fèi)者利益以及民族宗教等方面都有巨大威脅，甚至?xí)p害國家形象[2]。還有一些商家為謀取利益隱瞞或更改說明書，甚至生產(chǎn)假冒偽劣產(chǎn)品[3]。而動物源性成分檢測能夠應(yīng)對這些問題，起到保護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益、維護(hù)民族利益、尊重宗教信仰以及防止牛海綿狀腦病[4]、傳染性海綿狀腦病、瘋牛病、口蹄疫等人畜傳染病傳播的作用[5]。

目前，動物源性成分檢測技術(shù)大多數(shù)都是建立在對樣品蛋白質(zhì)、DNA、脂肪酸等分子結(jié)構(gòu)、序列或組成特異性分析的基礎(chǔ)上，涉及到的技術(shù)手段包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[6-10]、電泳[11-12]、色譜[13]、質(zhì)譜[14]、生物傳感分析[15-16]和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[17-18]等。DNA是一種相當(dāng)穩(wěn)定的有機(jī)分子，其在強(qiáng)烈的熱處理之后仍能保持穩(wěn)定性[19]。以DNA為基礎(chǔ)的PCR以其快速、高靈敏度、強(qiáng)特異性、動態(tài)檢測范圍較大、易自動化及能夠減少交叉污染風(fēng)險等優(yōu)點(diǎn)成為近年來的研究熱點(diǎn)，尤其是TaqMan實(shí)時熒光定量PCR法，它能夠通過實(shí)時監(jiān)測每個循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物而實(shí)現(xiàn)定性或定量檢測。

驢肉具有高蛋白、低脂肪、高氨基酸、低膽固醇的特點(diǎn)，其膽固醇和脂肪含量均低于牛肉和豬肉，而氨基酸和不飽和脂肪酸含量均高于后者，且驢肉肌纖維最細(xì)[20]，是高血壓、肥胖癥、動脈硬化患者和老年人最理想的營養(yǎng)品[21]。由于驢生長周期較長，導(dǎo)致驢肉資源缺乏，其價格不斷攀升[22]，許多不法商戶為追求利潤，使用小牛肉、馬肉、騾子肉，甚至豬肉、雞肉或鴨肉冒充驢肉進(jìn)行銷售，嚴(yán)重?fù)p害了廣大消費(fèi)者的權(quán)益。目前我國對各類動物源性食品進(jìn)行定性或定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)屈指可數(shù)，更缺乏TaqMan實(shí)時熒光PCR法檢測驢源性成分的報道[23]。因此，研究簡易、靈敏、低成本的驢肉摻假檢測方法，為相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)刻不容緩。本研究根據(jù)SN/T 3730.4—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測 實(shí)時熒光PCR法》[24]設(shè)計(jì)引物和探針，建立鮮肉及加工肉制品中驢源性成分的TaqMan實(shí)時熒光PCR檢測方法，旨在靈敏、準(zhǔn)確、快速地檢測出驢源性成分，規(guī)范食品市場。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮肉及加工肉制品購于錫林浩特市德克隆超市。鮮肉包括驢肉、牛肉、羊肉、豬肉、馬肉、駱駝肉、鹿肉、狗肉、兔子肉、雞肉、鴨肉、鴿子肉和鵪鶉肉；加工肉制品包括五香驢肉、羊肉干、牛肉干、肉粒多豬肉腸、馬肉干、鹵香水牛肉、鹵汁牦牛肉干、熏兔肉、鵪鶉蛋、雞蛋和鴨脖。樣品采集后去除明顯脂肪，并用滅菌水清洗，置于-20 ℃保存。

TransStart Probe qPCR SuperMix 北京全式金生物技術(shù)有限公司；qPCR引物和探針合成 北京睿博興科公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5418R高速臺式離心機(jī) 德國Eppendorf AG公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白測定儀 美國Thermo Fisher公司；7300 plus實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針合成

根據(jù)SN/T 3730.4—2013，委托北京睿博興科公司合成引物和探針。引物與探針序列如表1所示。

1.3.2 樣品DNA提取

取少量（約100 mg）鮮肉及加工肉制品，用剪刀剪碎或進(jìn)行研磨處理，利用溴化十六烷三甲基銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[25-26]提取其DNA，方法如下：稱取適量預(yù)先處理好的樣品約50 mg，置于1.5 mL離心管中，加入DNA裂解液800 mL，旋渦混勻，65 ℃金屬浴30 min，期間不時振蕩混勻；在13 000 r/min條件下離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于潔凈離心管中，加入等體積三氯甲烷-異戊醇（24∶1，V/V）混合液，充分混勻，13 000 r/min條件下離心5 min；取上清液于新的離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，13 000 r/min條件下離心5 min；棄去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀1 次，晾干，加入適量的ddH2O溶解，利用Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀測定其濃度。將母液稀釋至100 ng/mL左右，保存于-20 ℃，備用。

1.3.3 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

反應(yīng)體系：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 mL、左右引物各1 mL、探針1 mL，模板DNA 2 mL，補(bǔ)水至20 mL。

反應(yīng)條件：94 ℃、1 min，1 個循環(huán)；94 ℃、34 s，60 ℃、45 s，40 個循環(huán)，在每次循環(huán)退火時收集熒光。

1.3.4 特異性實(shí)驗(yàn)

分別取驢、牛、羊、豬、馬、駱駝、鹿、狗、兔、雞、鴨、鴿子、鵪鶉13 種動物的鮮肉組織，提取其DNA，進(jìn)行特異性檢測實(shí)驗(yàn)。采用熒光定量PCR方法，根據(jù)各反應(yīng)體系循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值的不同來驗(yàn)證引物和探針對于不同動物DNA模板的特異性。

1.3.5 檢出限及靈敏度測定實(shí)驗(yàn)

將質(zhì)量濃度為100 ng/mL的驢肉原液模板DNA加滅菌ddH2O稀釋，共稀釋7 次，使其質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/mL，以不同稀釋度的樣品DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件同1.3.3節(jié)，進(jìn)行靈敏度測定。

將驢肉DNA與馬肉DNA以一定比例混合，使其中驢肉DNA的含量分別為10.00%、1.00%、0.10%和0.01%，按照1.3.3節(jié)中的反應(yīng)體系對方法靈敏度進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用ABI 7300 plus實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增儀自帶的分析軟件進(jìn)行擴(kuò)增曲線和Ct值分析。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2和圖1可知，在熒光定量PCR檢測中，只有驢肉樣品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，其他12 種動物的基因組DNA均未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且5 個驢肉樣品的Ct值分別為17.73±0.16、18.38±0.14、18.56±0.10、18.70±0.18和18.54±0.24。

泳道M. 100 bp DNA Marker；泳道1～5. 驢肉DNA；泳道6～17. 分別為牛肉、羊肉、豬肉、馬肉、駱駝肉、鹿肉、狗肉、兔肉、雞肉、鴨肉、鴿子肉和鵪鶉肉的DNA。

由圖2～3可知，提取的DNA及擴(kuò)增產(chǎn)物均未出現(xiàn)降解，表明以上分析結(jié)果能證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。最后對驢肉模板DNA實(shí)時熒光定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過對測序結(jié)果與NCBI進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與野驢Gina線粒體基因（Accession No.：MG885769.1）的一致性為100%。

2.2 檢出限及靈敏度測定結(jié)果

2.2.1 檢出限

由圖4和表3可知：稀釋至0.000 1 ng/μL（即100 fg/μL）的驢基因組DNA樣本出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值為37.27±0.36；當(dāng)稀釋至0.000 01 ng/μL（即10 fg/μL）時，驢基因組DNA樣本中未檢測出驢源性成分，說明驢特異性引物和探針的檢出限可達(dá)100 fg/μL。

2.2.2 靈敏度

由圖5和表4可知，當(dāng)DNA混合物中驢肉DNA的含量為0.01%時有典型的擴(kuò)增曲線，且Ct值為30.97±0.40，上述結(jié)果充分表明本研究中的探針和引物具有較高的靈敏度。

2.3 定量檢測

利用熒光定量PCR儀自帶軟件，根據(jù)驢DNA質(zhì)量濃度的對數(shù)值與其對應(yīng)的Ct值的線性關(guān)系，得到特異性探針的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.334x+43.985（R2=0.996 9），說明本研究中的引物和探針具有較好的定量檢測能力。

2.4 加工肉制品的檢測

提取從超市購買的五香驢肉、羊肉干、牛肉干、肉粒多豬肉腸、馬肉干、鹵香水牛肉、鹵汁牦牛肉干、熏兔、鵪鶉蛋、雞蛋和鴨脖的DNA，對其進(jìn)行熒光定量PCR（TaqMan探針方法）擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。由表5可知，只有驢肉制品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，且Ct值為15.01±0.09，其余制品均未檢出驢源性成分，說明本研究中的引物和探針具有較高的適用性及特異性，可用于市售制品中驢源性成分的檢測。

3 討 論

本研究建立了用于檢測市售鮮肉及肉制品中驢源性成分的TaqMan實(shí)時熒光定量PCR法，與常用的常規(guī)PCR法相比，將檢測周期從至少4 h減少至1 h左右，檢測效率提高了3 倍，免去了常規(guī)PCR檢測鑒定可疑陽性樣品必須進(jìn)行的酶切、電泳和DNA測序等步驟，并且檢測過程中在封閉體系中進(jìn)行擴(kuò)增，降低了PCR產(chǎn)物被污染的可能性[27-29]。

本研究根據(jù)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3730.4—2013合成引物和探針，但是在標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上拓展了特異性、靈敏度和檢出限等的檢測，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行定量分析，即通過標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測DNA進(jìn)行絕對定量，快速分析出樣品中是否含有驢源性成分及其含量和比例。

首先以驢、牛、羊、豬、馬、駱駝、鹿、狗、兔、雞、鴨、鴿子和鵪鶉等13 種動物的基因組DNA為模板進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，其中牛、羊、馬等動物與驢具有較高相似度，且馬和驢的DNA序列具有高度同源性，使得馬和驢的區(qū)分充滿挑戰(zhàn)性[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沒有交叉擴(kuò)增情況出現(xiàn)，證明了引物和探針的高度特異性。其次，對驢組分DNA進(jìn)行梯度稀釋，檢測其最低檢出限，結(jié)果表明，當(dāng)驢組分DNA達(dá)到100 fg/μL級時也能成功被檢測到，并且所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2>0.99，表明可行度和線性關(guān)系較好。然后，將馬肉基因組DNA與驢肉DNA混合，使驢肉DNA的含量分別為10.00%、1.00%、0.10%和0.01%，結(jié)果表明，當(dāng)驢肉DNA含量為0.01%時也有明顯的擴(kuò)增曲線，其Ct值約為30，表明引物和探針組合具有較高的靈敏度。在已有研究中，付理文等[31]通過豬、牛、羊、雞、鴨、鵝6 種動物的基因組，開發(fā)出六重?zé)晒舛縋CR方法，檢測靈敏度達(dá)pg級；張馳等[32]開發(fā)出一種鴨源性成分檢測方法，檢測靈敏度達(dá)1.78 pg/μL；程欣等[33]通過研究雞、鴨、驢、牛等11 種動植物的基因組，建立了用于檢測鴨源性成分的熒光定量PCR方法，檢測靈敏度達(dá)0.5 pg/μL；卞如如等[34]建立了同時檢測驢、馬和狐貍源性成分的四重實(shí)時熒光PCR方法，檢測靈敏度為0.01 ng/μL；Tanabe等[35]建立了定量檢測食品中豬肉、雞肉、牛肉、羊肉和馬肉的實(shí)時定量PCR方法，檢測靈敏度達(dá)100 pg/μL；Zhang等[36]應(yīng)用TaqMan實(shí)時熒光PCR方法定量檢測肉、乳和奶酪中的牛源性成分，檢出限為35 pg/μL。上述研究中的檢出限和靈敏度均低于本研究。最后，對市售肉制品進(jìn)行了驢源性成分檢測，檢測結(jié)果與肉制品標(biāo)簽一致，說明本研究中的引物和探針組合具有廣泛適用性。綜上所述，以本研究中的引物和探針為基礎(chǔ)的檢測方法為肉及肉制品中驢源性成分的檢測提供了技術(shù)保障，本研究中的方法具有較高的特異性、靈敏度及較廣泛的適用性，也是預(yù)防人畜傳染病傳播、防止不法商家摻假牟利的有效手段。

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