山東省鴨類感染豬圓環(huán)病毒3型的初步調(diào)查

劉玉偉 辛長(zhǎng)勛 王碩 高梅 鄭書軒 時(shí)建立 彭喆 吳曉燕 王金寶 李俊

摘要：2016年，美國(guó)學(xué)者首次從患有皮炎腎病綜合征和繁殖障礙母豬體內(nèi)檢測(cè)到一種新發(fā)的豬圓環(huán)病毒，命名為豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus 3，PCV3）。山東省豬群已檢測(cè)出PCV3陽(yáng)性感染，而對(duì)于山東省鴨類PCV3的感染情況未有報(bào)道。本研究采用PCR檢測(cè)方法，對(duì)山東省鴨場(chǎng)采集的146份樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)，檢出陽(yáng)性率為零，表明山東省鴨類不存在PCV3感染。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒3型；鴨；PCR；山東省

中圖分類號(hào)：S858.322.65+9.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）05-0126-03

Abstract In 2016， a new type of porcine circovirus named as Porcine circovirus 3 （PCV3） from sows with dermatitis-nephritic syndrome and reproductive failure was first reported in America. PCV3 has been detected in sows and live-born infants in Shandong Province. However， the infection of PCV3 in ducks has not been reported. In this study， 146 samples were collected from duck farms in Shandong Province. The samples were tested by PCV3 PCR. The results showed zero positive. In conclusion， there was no PCV3 infection in ducks in Shandong Province.

Keywords Porcine circovirus 3； Duck； PCR； Shandong Province

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是單股閉合環(huán)狀DNA 病毒，粒子直徑平均為17 nm，無(wú)囊膜，是目前已報(bào)道的最小的動(dòng)物類病毒[1]。豬圓環(huán)病毒是圓環(huán)病毒屬的代表種，根據(jù)其致病性、抗原性及核苷酸序列的差異性，將其劃分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）。

PCV1不產(chǎn)生細(xì)胞病變，不會(huì)引起豬的發(fā)病[2]。PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征[3]，同時(shí)還與母豬繁殖障礙[4]、豬皮炎與腎病綜合征[5]、豬壞死性及增生性肺炎[6]等疾病密切相關(guān)。世界各地規(guī)?；i場(chǎng)普遍存在PCV2感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成的危害不可估計(jì)。

2016年，美國(guó)學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了PCV3[7]。目前，山東省豬群已檢測(cè)出PCV3陽(yáng)性感染[8，9]。有報(bào)道稱，中國(guó)的犬類也檢測(cè)出PCV3陽(yáng)性感染[10]。山東省作為中國(guó)的養(yǎng)鴨大省，鴨類是否感染PCV3尚未報(bào)道。為了解山東省鴨群PCV3的情況，本研究從山東省6個(gè)鴨場(chǎng)隨機(jī)采集146份樣品，采用PCR檢測(cè)方法進(jìn)行PCV3檢測(cè)，以期為山東省鴨類是否受PCV3的威脅提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在山東省的6個(gè)鴨場(chǎng)隨機(jī)采集116份血清和30份組織樣品（淋巴結(jié)、脾臟、肺臟）。

1.2 主要試劑與儀器

10%十二烷基硫酸鈉（SDS）、蛋白酶K、Tris飽和酚均購(gòu)自北京Solarbio公司；無(wú)水乙醇、70%乙醇和三氯甲烷均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雙蒸水購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；DL-2000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；2×Taq PCR StarMix購(gòu)自上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司。

組織裂解器購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；DK-8D型電熱恒溫水槽購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；移液槍和臺(tái)式離心機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；PTC-2000型PCR儀購(gòu)自美國(guó)MJ Research公司；凝膠成像儀購(gòu)自Alpha Innotech公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank公布的PCV3 基因序列，在其高度保守區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件輔助設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增片段為330 bp。由生工生物工程（上海）股份有限公司負(fù)責(zé)合成引物。引物序列見(jiàn)表1。

1.3.2 DNA提取 根據(jù)《動(dòng)物病毒學(xué)》[11]，采用SDS-蛋白酶K法提取DNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 將提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)采用20 μL體系，依次在反應(yīng)管中加入2×Taq PCR StarMix 10 μL、PCV3-F 1 μL、PCV3-R 1 μL、DNA模板1 μL，最后加雙蒸水至體積為20 μL。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出5 μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。剩余產(chǎn)物保存于4℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用所設(shè)計(jì)的PCV3引物對(duì)陰、陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖1所示， PCV3陽(yáng)性樣品可擴(kuò)增出1條約330 bp條帶，與預(yù)期片段大小相符；陰性樣品無(wú)條帶。

2.2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

圖2為部分樣品PCV3檢測(cè)結(jié)果。 146份臨床樣品均為PCV3陰性，陽(yáng)性率為零。由于本次調(diào)查僅選取山東省內(nèi)6個(gè)鴨場(chǎng)且在冬季進(jìn)行檢測(cè)，氣溫較低且穩(wěn)定，使得鴨群疾病發(fā)生率較低，所以調(diào)查結(jié)果可能存在一定的片面性與局限性，更加全面有效的PCV3感染情況有待于進(jìn)一步的調(diào)查研究。

3 討論與結(jié)論

自2016年美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道PCV3以來(lái)，中國(guó)等國(guó)家豬群相繼檢測(cè)出PCV3陽(yáng)性感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成的損失不容忽視。隨著中國(guó)犬類感染PCV3的報(bào)道，PCV3的陽(yáng)性感染與防控得到越來(lái)越多的關(guān)注與重視。目前，對(duì)于PCV3的研究還處于初級(jí)階段，市場(chǎng)嚴(yán)重缺乏針對(duì)性的疫苗和藥物。鑒于PCV3存在傳播速度快、途徑多、范圍廣的特征，今后在飼養(yǎng)過(guò)程中需要更加重視PCV3的研究和監(jiān)控工作。首先，豬場(chǎng)需要加強(qiáng)生物安全體系，提高飼養(yǎng)管理水平，增強(qiáng)豬群免疫力，切斷病毒和有害細(xì)菌傳播途徑；其次，加快開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的研究，建立PCV3快速、靈敏、特異的血清學(xué)檢測(cè)方法及相關(guān)檢測(cè)技術(shù)，如利用膠體金免疫層析技術(shù)制備PCV3抗原檢測(cè)試紙條等，對(duì)出入口岸農(nóng)畜產(chǎn)品進(jìn)行PCV3快速篩查；最后，分離與鑒定 PCV3毒株，進(jìn)而開(kāi)展疫苗研發(fā)與動(dòng)物回歸試驗(yàn)，為我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。

山東省鴨類養(yǎng)殖規(guī)模較大，目前尚無(wú)山東省鴨群存在PCV3陽(yáng)性感染的報(bào)道。本次調(diào)查沒(méi)有檢測(cè)出山東省鴨類PCV3的陽(yáng)性感染，初步表明，目前山東省鴨類不存在PCV3感染，說(shuō)明PCV3對(duì)山東省鴨群暫時(shí)沒(méi)有造成威脅。推測(cè)PCV3主要在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引起感染，鳥類不會(huì)感染此病毒。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Tischer I， Gelderblom H， Vettermann W， et al. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA[J]. Nature， 1982， 295（5488）：64-66.

[2] Tischer I， Mields W， Wolff D， et al. Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus[J]. Arch. Virol.， 1986， 91（3/4）： 271-276.

[3] Baekbo P， Kristensen C S， Larsen L E. Porcine circovirus diseases： a review of PMWS[J]. Transbound Emerg. Dis.， 2012， 59（S1）： 60-67.

[4] Karuppannan A K， Ramesh A， Reddy Y K， et al. Emergence of porcine circovirus 2 associated reproductive failure in Southern India[J]. Transbound Emerg. Dis.，2016， 63（3）： 314-320.

[5] Allan G M， McNeilly E， Kennedy S， et al. PCV-2-associated PDNS in Northern Ireland in 1990. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome[J]. Vet. Rec.， 2000， 146（24）：711-712.

[6] Szeredi L， Szentirmai C. Proliferative and necrotising pneumonia and severe vascular lesions in pigs naturally infected with porcine circovirus type 2[J]. Acta Vet. Hung.， 2008， 56（1）： 101-109.

[7] Pallnski R， Pieyro P， Shang P， et al. A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J]. J. Virol.， 2016， 91（1）： e01879-16.

[8] 劉曉東，楊旭兵，鄭慶禮，等. 我國(guó)部分?。▍^(qū)）豬圓環(huán)病毒3型的分子流行病學(xué)研究[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2017，38（11）：18-21.

[9] Zheng S X， Wu X Y， Zhang L L， et al. The occurrence of porcine circovirus 3 without clinical infection signs in Shandong Province[J]. Transbound Emerg. Dis.， 2017， 64（5）：1337-1341.

[10]Zhang J X， Liu Z G， Zou Y W， et al. First molecular detection of porcine circovirus type 3 in dogs in China[J]. Virus Genes，2018，54（1）：140-144.

[11]殷震，劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 第2版. 北京： 科學(xué)出版社， 1997： 681-688.