高通量分子標(biāo)記技術(shù)輔助回交選育高油酸花生新種質(zhì)

徐平麗 唐桂英 付春 柳展基 魯成凱 姜言生 單雷

摘要：以山東大花生魯花14號(hào)（LH14）為母本、高油酸花生開農(nóng)176（KN176）為父本配置雜交組合，再以LH14為輪回親本歷經(jīng)4次回交獲得BC4F1，期間用TaqMan探針標(biāo)記技術(shù)輔助雜種AhFAD2B基因型選擇；BC4F1經(jīng)連續(xù)自交、田間篩選并輔助KASP分子標(biāo)記鑒別后代籽粒AhFAD2B基因的基因型，獲得基因型aabb的BC4F5株系10個(gè)，它們分別來源于BC4F1代7個(gè)單株。分析這10個(gè)株系產(chǎn)量及品質(zhì)性狀，結(jié)果顯示各株系結(jié)果集中，單株平均莢果數(shù)、果型與母本LH14相似，油酸含量為68.67%～77.93%；其中7個(gè)株系的百果重、飽果率和6個(gè)株系的百仁重分別比對(duì)照LH14提高0.02%～16.05%、4.55%～12.31%和0.05%～9.41%。綜合各株系田間表現(xiàn)及籽粒品質(zhì)指標(biāo)，最終選擇油酸含量高于70%的7個(gè)BC4F5代株系進(jìn)行DUS測(cè)試、品種區(qū)試和生產(chǎn)試驗(yàn)。TaqMan探針標(biāo)記與KASP標(biāo)記結(jié)合應(yīng)用于高油酸品種選育過程中，大大減少了田間選擇的工作量，提高了回交選育高油酸花生的效率。

關(guān)鍵詞：花生；高油酸；回交；分子標(biāo)記輔助選育

中圖分類號(hào)：S565.203.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）06-0046-07

Abstract The cross combination， Luhua 14 （LH14） ×Kainong 176 （KN176）， was made using large-seeded peanut cultivar LH14 as female parent and KN176 with high oleic acid content as male parent. Furthermore， using LH14 as recurrent parent，BC4F1 generation was obtained by successive backcrosses for 4 times. The AhFAD2B genotype single plant from each generation （including F1 and BC1F1-BC4F1） was determined by TaqMan probe method. Ten lines of BC4F5 generation derived from 7 single plants of BC4F1 were obtained by continuous self-crossing through screening in field by agronomic traits combined with genotype identification of AhFAD2B gene by high-throughput KASP molecular marker. These 10 BC4F5 lines with aabb genotype were evaluated in yield and quality traits. The results showed that the average pod number and pod shape of each line were similar to those of maternal LH14， and the oleic acid content of different lines arranged from 68.67% to 77.93%. Compared with LH14， the weight of hundred pods and percent of plump pods per plant in 7 lines， and the hundred-kernel weight in 6 lines increased by 0.02%～16.05%，4.55%～12.31 % and 0.05%～9.41%， respectively. According to overall performance of agronomic characters and kernel quality， 7 BC4F5 lines with oleic acid content above 70% were chosen for DUS test， variety regional trail and production test. The effective application of TaqMan probe method and high-throughput KASP technology in high-oleic peanut breeding greatly reduced the workload of selection in field and improved the breeding efficiency.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）； High oleic acid； Backcross； Molecular marker assisted selection

花生是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物?；ㄉ蚜Ｖ舅岬慕M成是衡量花生品質(zhì)的重要指標(biāo)。油酸、亞油酸是花生籽粒脂肪酸的主要成分，含量分別占其總脂肪酸含量的36.1%～67.0%、13.0%～43.0%；此外還包括硬脂酸1.3%～6.5%、軟脂酸6.0%～11.5%和亞麻酸（<0.1%）等[1]。油酸含有單不飽和鍵，相比亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸更穩(wěn)定，提高油酸含量可以改善花生及花生制品的口味和氧化穩(wěn)定性，因此，高油酸花生作為一種優(yōu)質(zhì)的油脂來源，越來越受到消費(fèi)者的青睞[2，3]。

我國(guó)高油酸花生育種研究起步較晚、育成的品種比較少，且大多來源于美國(guó)突變體F435及其衍生系。F435的油酸含量80%，亞油酸僅占2%，其油酸性狀由兩對(duì)非等位基因AhFAD2A和AhFAD2B控制，AhFAD2A基因448nt處G→A堿基的替代以及AhFAD2B基因442nt處A堿基的插入，導(dǎo)致了高油酸性狀的產(chǎn)生[4-8]。針對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)，近年來研究者開發(fā)了多種類型的分子標(biāo)記，如限制性酶切擴(kuò)增多態(tài)性（CAPS，cleaved amplified polymorphic sequence）、等位基因特異PCR（AS-PCR，allele-specific PCR）、TaqMan探針標(biāo)記及KASP（kompetitive allele specific PCR）標(biāo)記等。這些標(biāo)記已被用于鑒別AhFAD2A和AhFAD2B基因的等位差異，并開始應(yīng)用于高油酸花生育種過程[9-12]。

為了選育適應(yīng)山東及北方大花生產(chǎn)區(qū)的高油酸花生新品種，我們以山東大花生品種魯花14號(hào)為母本及輪回親本、高油酸花生KN176為父本，將TaqMan探針標(biāo)記及KASP標(biāo)記檢測(cè)手段輔助應(yīng)用在整個(gè)回交、自交選育過程中，有效縮短了花生高油酸的選育進(jìn)程，并選育出一系列油酸含量高于70%的花生新品系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 親本材料 母本魯花14號(hào)（LH14），O/L比值1.70，山東省花生研究所提供。父本開農(nóng)176（KN176），O/L比值11.13，開封市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的高油酸花生品種，種子由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所黃冰艷研究員提供。

1.1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司（TIANGEN，中國(guó)北京）產(chǎn)品；熒光定量PCR使用大連TaKaRa生物技術(shù)公司（TaKaRa，中國(guó)大連）產(chǎn)品Premix Ex Taq（probe qPCR）；KASP Master mix為L(zhǎng)GC公司（英國(guó)）產(chǎn)品。

1.1.3 引物和探針 用于熒光定量的引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（中國(guó)上海）合成，KASP檢測(cè)引物由英國(guó)LGC公司（英國(guó)）合成?；ㄉs交、回交選育過程中TaqMan qPCR檢測(cè)引物和探針序列、KASP檢測(cè)的引物序列參見徐平麗等（2016）報(bào)道[11]。

1.2 方法

1.2.1 選育過程 2013年春，播種親本LH14和KN176種子于雜交池中，盛花期開始雜交，秋季收獲F1代雜交種子，TaqMan探針法檢測(cè)F1代種子AhFAD2A和AhFAD2B基因的基因型，篩選獲得真雜種。KN176 AhFAD2A和AhFAD2B基因型分別為aa和bb， LH14 AhFAD2A和AhFAD2B基因型為aa和BB[13]，兩個(gè)親本的AhFAD2A均已突變?yōu)閍a，因此，F(xiàn)1真雜種 AhFAD2A和AhFAD2B基因的基因型為aaBb，后代檢測(cè)只針對(duì)AhFAD2B基因型即可。同年冬季于海南加代回交，LH14作輪回親本，F(xiàn)1代基因型aaBb雜交種作父本，回交獲得BC1F1種子，TaqMan探針法篩選基因型aaBb的BC1F1真雜種，用作進(jìn)一步的回交父本。2014年春、冬兩季和2015年春季，繼續(xù)與輪回親本回交、TaqMan探針法篩選基因型aaBb真雜種。2015年秋收獲BC4F1種子，同年冬季于海南自交加代，2016年春收獲BC4F2代種子，播種于濟(jì)南飲馬泉試驗(yàn)基地進(jìn)行單株選擇，KASP法輔助檢測(cè)它們的基因型；秋季單株收獲基因型為 aabb和aaBb的BC4F3代種子。2016年冬及2017年春和冬，株行種植基因型 aabb的選留單株，BC4F4、BC4F5代選擇與LH14田間農(nóng)藝性狀基本相似株系，并用近紅外反射光譜法對(duì)油酸含量進(jìn)行輔助選擇（圖1）。

1.2.2 花生種子和葉片DNA提取 手術(shù)刀切取花生種子遠(yuǎn)離胚根端約0.4 mm厚的子葉組織薄片，或取田間新鮮幼嫩花生葉片約1 g，放入1.5 mL Eppendorf管中，按照TIANGEN公司植物基因組DNA提取試劑盒提供的方法提取花生種子或葉片基因組DNA，溶解于適量無菌去離子水中。分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量，并稀釋至合適的濃度備用。

1.2.3 TaqMan探針標(biāo)記檢測(cè)AhFAD2B基因型 以基因組DNA為模板，針對(duì)AhFAD2B 442位A/- InDel的擴(kuò)增引物對(duì)為qFAD2B-F和qFAD2B-R，區(qū)分野生型位點(diǎn)和突變體位點(diǎn)A堿基插入的熒光探針為qFAD2B-p0和qFAD2B-pA442，在ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）上按照基因分型實(shí)驗(yàn)流程操作進(jìn)行。引物序列信息及PCR反應(yīng)體系、實(shí)驗(yàn)程序按照徐平麗等（2016）的方法進(jìn)行[11]。

1.2.4 KASP高通量檢測(cè)AhFAD2B基因型 以基因組DNA為模板，針對(duì)AhFAD2B 442位A/- InDel的正向引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI，反向引物kFAD2B-R；引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI的5′端分別與加尾序列Allele-1 tail和Allele-2 tail相連，等位差異設(shè)計(jì)在引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI的3′端。通用引物（與加尾序列相同）的5′端分別標(biāo)記FAM和HEX熒光。根據(jù)收集熒光的不同，確定基因分型。引物信息及KASP反應(yīng)體系、實(shí)驗(yàn)程序等按照徐平麗等（2016）的方法進(jìn)行[11]。

1.2.5 回交后代材料的田間選擇 從BC4F2代開始，對(duì)自交群體單株進(jìn)行苗期田間調(diào)查，記錄其出苗、苗期生長(zhǎng)、開花、結(jié)果及抗病性等情況，選擇綜合性狀良好，特別是株型直立、結(jié)果集中、飽果率高、果型好的單株繼續(xù)傳代進(jìn)行篩選，并輔助基因型篩選；BC4F4代執(zhí)行株行選擇，對(duì)基因型為aabb的株行田間表現(xiàn)進(jìn)行調(diào)查，選擇整齊一致且收獲期表現(xiàn)良好的株行作為進(jìn)一步擴(kuò)繁的材料；BC4F5則選取重要農(nóng)藝性狀相似于母本材料LH14的優(yōu)良株行，每個(gè)同一來源的株行作為一個(gè)株系；基因型為aaBb的優(yōu)良單株作為備選單株，留作后續(xù)基因型隱性純合后進(jìn)一步田間篩選。

1.2.6 BC4F5代材料高油酸株系產(chǎn)量及品質(zhì)分析 收獲時(shí)統(tǒng)計(jì)基因型aabb的BC4F5材料的單株莢果數(shù)、飽果率、株型、株高、分枝數(shù)等性狀，計(jì)算各株系的百果重、百仁重等重要產(chǎn)量指標(biāo)。BC4F5各株系的各項(xiàng)農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀以輪回親本LH14為對(duì)照進(jìn)行比較。

利用波通儀器公司的DA7250型近紅外分析儀，通過近紅外反射光譜（near infrared reflectance spectroscopy，NIRs），初步分析籽粒的油酸、亞油酸含量、蛋白質(zhì)含量和含油量等品質(zhì)指標(biāo)，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaqMan探針鑒定F1代及回交各世代花生種子基因型

由于配制組合選用的高油酸親本KN176基因型為aabb，母本材料LH14的基因型為aaBB[13]，因此，基因型aaBb的F1代即為真雜種。為進(jìn)一步改良母本的油酸性狀，后續(xù)回交世代選取基因型aaBb的F1、BC1F1、BC2F1、BC3F1代真雜種依次作回交父本，最終通過一次雜交、四次回交獲得BC4F1代。

F1、BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1世代材料樣本量不大，利用TaqMan探針法篩選基因型為aaBb的這些世代真雜種單株材料。受雜交池和海南加代條件等限制，以及雜交技術(shù)的影響，盡管我們雜交了大量的花，但獲得的真雜種數(shù)量較少，特別是F1代（表1）。不過，由于TaqMan探針法能保證檢測(cè)的準(zhǔn)確率（>95%），因此這些雜種作為回交父本可滿足回交要求。

2.2 KASP技術(shù)鑒定BC4F2及其它自交后代單株的基因型

將基因型為aaBb的BC4F1種子播種在試驗(yàn)田，結(jié)合單株結(jié)果數(shù)、飽果數(shù)、果型、株型、葉型等田間綜合性狀，終選10個(gè)單株收獲BC4F2自交后代種子。通過基因型鑒定，aabb和aaBb的BC4F2單株繼續(xù)種植，并結(jié)合田間綜合表現(xiàn)進(jìn)行篩選，共獲得25個(gè)BC4F3單株（5個(gè)aabb，20個(gè)aaBb），它們來源于8個(gè)BC4F1系?；蛐丸b別為aabb的5個(gè)單株收獲的BC4F4種子株行種植，進(jìn)一步選擇綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良的BC4F5；同時(shí)基因型為aaBb單株收獲的種子繼續(xù)基因型鑒別和單株選擇，最終篩選獲得來源于7個(gè)BC4F1株、基因型為aabb且綜合性狀良好的BC4F5代株系10個(gè)，并分別編號(hào)（世代-粒編號(hào)-株系）。利用KASP標(biāo)記檢測(cè)種子基因型（上代基因型aabb的后代種子不再分型檢測(cè)），檢出率高于93.49%，有效保證了選育高油酸性狀的準(zhǔn)確性和效率，部分分型結(jié)果見表2。

2.3 花生高油酸株系的獲得及BC4F5代材料的產(chǎn)量性狀分析

經(jīng)過BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1各回交后代基因型檢測(cè)及BC4F2、BC4F3代自交群體田間單株選擇、BC4F4株行選擇并輔助基因型選擇，篩選獲得來源于BC4F2的7個(gè)單株基因型為aabb的BC4F5 10個(gè)株系。調(diào)查BC4F5代10個(gè)株系的各株行田間表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，選育的各株系株型直立緊湊、結(jié)果集中，4個(gè)株系的主莖高為38～45 cm、1個(gè)株系高于65 cm、其余株系主莖高在45～65 cm之間，分枝數(shù)8～12個(gè)，果型與母本LH14相似（圖2，表3）。與對(duì)照LH14相比，大多數(shù)株系平均百果重、百仁重和飽果率好于對(duì)照。其中7個(gè)株系平均百果重為172.41～200.04 g，與對(duì)照相比，提高幅度為0.02%～16.05%，平均提高（4.98±5.65）%；7個(gè)株系的平均飽果率為76.71%～82.41%，提高幅度4.55%～12.31 %，平均提高（8.16±2.80）%；6個(gè)株系平均百仁重為73.25～80.10 g，提高幅度為0.05%～9.41%，平均提高（4.81±3.34）%。選出株系單株平均莢果數(shù)為16.44～19.65個(gè)，與LH14相比沒有明顯差異（表4）。各株系之間以及與對(duì)照親本之間，單株平均莢果數(shù)差異不顯著，平均百果重、平均百仁重、平均飽果率差異顯著，不同株系之間的表現(xiàn)略有不同，這些將作為終選株系的重要參考指標(biāo)。

2.4 BC4F5高油酸株系籽粒品質(zhì)性狀分析

采用近紅外反射光譜法初步分析了BC4F5部分株系（30～50粒/株系）籽粒油酸、亞油酸、蛋白質(zhì)含量及含油量等品質(zhì)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)基因型為aabb的BC4F5代10個(gè)株系，油酸含量在68.67%～77.93%之間，平均為（74.09±3.37）%，大部分選留株系的油酸含量已達(dá)70%以上（表5）。最終，綜合考慮株型、株高、飽果率、百果重及近紅外光譜初步測(cè)定的品質(zhì)指標(biāo)，選擇7個(gè)BC4F5代優(yōu)良株系作為后續(xù)品種比較的材料。其中BC4F5-143-1、BC4F5-145-4、BC4F5-199-8、BC4F5-202-10油酸含量高于75%，BC4F5-144-1、BC4F5-170-6、BC4F5-198-8油酸含量高于73%。株系BC4F5-172-7、BC4F5-176-7油酸含量在68%～69%之間，低于預(yù)期，并且它們的株高較高，百果重、飽果率都較低，因此被淘汰。雖然BC4F5-162-5油酸含量也達(dá)到73%，但因其株高等因素落選。此外，由于蛋白質(zhì)、含油量對(duì)花生種子的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響，后續(xù)的研究中也是我們進(jìn)一步關(guān)注的性狀 。

3 討論

截止2016年底，我國(guó)共育成38個(gè)高油酸花生品種，18個(gè)大粒品種，20個(gè)小粒品種[2]，高油酸品種相對(duì)較少。這些品種主要是通過雙親雜交后系譜法選育的，控制高油酸性狀的基因來源于美國(guó)高油酸品種F435及其衍生系?；亟贿x育作為創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)花生種質(zhì)資源手段之一，可以通過多輪次回交將某個(gè)優(yōu)良性狀定向轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有推廣的優(yōu)良品種中，同時(shí)保留該品種的其它優(yōu)良特性。

魯花14號(hào)屬于比較適應(yīng)北方花生產(chǎn)區(qū)的大花生，株型直立緊湊，蛋白質(zhì)含量23.6%，粗脂肪含量52.12%，普通油酸含量48.5%，油亞比1.70，抗旱、較抗多種葉部病害和條紋病毒病，品種適應(yīng)性廣。父本開農(nóng)176是我國(guó)第一個(gè)通過國(guó)家鑒定的高油酸花生，油酸含量76.8%，油亞比11.13，與美國(guó)F435來源的高油酸突變體基因型相同，控制油酸性狀的兩個(gè)基因AhFAD2A/AhFAD2B均已突變。我們期望通過多次回交將開農(nóng)176的高油酸性狀導(dǎo)入魯花14號(hào)，獲得既具備開農(nóng)176的高油酸性狀又保留了輪回親本魯花14號(hào)優(yōu)良性狀的高油酸新材料。作物回交育種實(shí)踐表明，作物性狀遺傳改良通過4～6次回交，多數(shù)可以達(dá)到預(yù)期效果[14]。理論上，通過1次雜交、4次回交，回交后代已具備輪回親本高于96%的性狀，后代已逐步接近輪回親本。選育過程中輔助分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)與油酸相關(guān)的基因型進(jìn)行篩選，大大減少了后期田間篩選的工作量，顯著提高了育種效率。再者，冬季在海南種子的加代工作，也有效縮短了高油酸花生的選種進(jìn)程[11]。