毛細(xì)管電泳的離子富集性能研究

(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司,北京 101200)

在分析化學(xué)研究領(lǐng)域，近年來(lái)毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE) 是發(fā)展較快的技術(shù)。近些年在一些重大國(guó)際研究項(xiàng)目中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[1]。毛細(xì)管電泳作為芯片實(shí)驗(yàn)室[2]最重要的基礎(chǔ)技術(shù)之一，在DNA與RNA分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、藥物分析等方面都有大量應(yīng)用[3]。

毛細(xì)管電泳分析金屬離子簡(jiǎn)單快速[4，5]，自20世紀(jì)末以來(lái),毛細(xì)管電泳被廣泛的應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子和其他低分子量離子的測(cè)定。由于一般的金屬離子不具有光學(xué)活性，對(duì)于金屬離子測(cè)定,多采用間接紫外檢測(cè)法，或者利用毛細(xì)管柱上濃縮技術(shù)，通過(guò)增加上樣量以提高檢測(cè)靈敏度。場(chǎng)增強(qiáng)進(jìn)樣、電堆積富集及等速電泳等多種模式都屬于柱上濃縮技術(shù)。電堆積富集利用樣品區(qū)帶與載體電解質(zhì)的電阻率不同，使得樣品離子堆積富集在樣品區(qū)帶與運(yùn)行區(qū)帶邊界處。金屬離子的測(cè)定也可以利用X射線(xiàn)熒光, 可以先進(jìn)行離子富集, 再進(jìn)行測(cè)定。

在線(xiàn)富集是提高毛細(xì)管電泳靈敏度的一種有效手段，由于對(duì)儀器要求低和操作簡(jiǎn)單得到了快速發(fā)展。由于單一富集的方法往往有一定的局限性，為了提高毛細(xì)管電泳的靈敏度，可將兩種或多種富集方法聯(lián)用。毛細(xì)管電泳在線(xiàn)富集方法研究的另一主要方向是將在線(xiàn)富集方法與高靈敏度檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合。對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中痕量及超痕量組分的富集是建立新富集方法的重點(diǎn)。新富集方法需要兼顧重現(xiàn)性高、無(wú)需離線(xiàn)預(yù)處理、富集時(shí)間短和操作簡(jiǎn)單等要求。由于在線(xiàn)富集技術(shù)在不斷的發(fā)展，今后毛細(xì)管電泳的檢測(cè)靈敏度會(huì)有顯著的提高。毛細(xì)管電泳在蛋白質(zhì)組學(xué)[6,7]、環(huán)境和食品科學(xué)等分析領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用。檢測(cè)手段的提高也進(jìn)一步拓展了毛細(xì)管電泳的應(yīng)用領(lǐng)域，像CE-MS聯(lián)用不僅分離效率高，且能提供結(jié)構(gòu)信息，在疾病的診治[8]及腫瘤的研究中[9]都是重要工具。

目前，從事毛細(xì)管電泳技術(shù)與應(yīng)用相關(guān)研究的科研院所、院校均配備商業(yè)化毛細(xì)管電泳儀，許多有條件的科研單位均選擇靈敏度更高的熒光檢測(cè)系統(tǒng)和全自動(dòng)化進(jìn)樣系統(tǒng)。目前分析儀器市場(chǎng)上性能突出的毛細(xì)管電泳儀基本為進(jìn)口儀器(如Agilent、Beckman等)，由于價(jià)格昂貴，限制了其進(jìn)入更多的實(shí)驗(yàn)室。因此開(kāi)發(fā)高性能、低成本、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)毛細(xì)管電泳儀器既能滿(mǎn)足相關(guān)領(lǐng)域更為廣泛的技術(shù)應(yīng)用需求、也能填補(bǔ)國(guó)內(nèi)分析儀器在中高端產(chǎn)品的市場(chǎng)空白。

1 原理

1.1 毛細(xì)管區(qū)帶電泳

電泳是指電解質(zhì)溶液在電場(chǎng)作用下，其中的帶不同電荷的粒子會(huì)以不同的速度朝與其所帶電荷相反的電場(chǎng)方向進(jìn)行遷移的現(xiàn)象。一般情況下毛細(xì)管電泳使用石英材料毛細(xì)管，當(dāng)石英毛細(xì)管在PH>3時(shí)，毛細(xì)管的內(nèi)表面會(huì)帶負(fù)電，而在與其接觸的溶液表面上則會(huì)形成一大小相等符號(hào)相反的電荷層,于是一雙電層存在于溶液與管壁的界面上。當(dāng)毛細(xì)管兩端施加一個(gè)高電壓時(shí)，雙電層中的水合陽(yáng)離子層會(huì)驅(qū)動(dòng)溶液整體在毛細(xì)管內(nèi)向負(fù)極流動(dòng)，這個(gè)溶液的整體流動(dòng)稱(chēng)為電滲流。電解質(zhì)溶液中的帶電粒子的電泳和電滲流的矢量就是離子在毛細(xì)管內(nèi)的遷移速度。帶電粒子在毛細(xì)管中的遷移過(guò)程中，帶正電荷粒子的電泳速度和電滲流速度方向相同，在各種粒子中最先流出。中性粒子不受電泳的影響，遷移速度就是電滲流的速度。由于負(fù)電性粒子的電泳方向與電滲流的方向相反，運(yùn)動(dòng)速度是電滲流與電泳速度之差(一般情況下電滲流速度大于電泳速度)，因此在毛細(xì)管電泳中帶負(fù)電荷的粒子是最后流出。不同種類(lèi)的粒子的分離就是利用了不同離子在毛細(xì)管電泳中的遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)的，利用這種分離原理的方法稱(chēng)為毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis，CZE)。區(qū)帶電泳是毛細(xì)管電泳的最常用形式，儀器裝置的組成主要包括毛細(xì)管、高壓電源、柱上檢測(cè)器和緩沖液貯瓶，兩個(gè)緩沖液貯瓶分別在毛細(xì)管的兩端且與高壓電源相連，常用電壓一般在數(shù)千伏至數(shù)十萬(wàn)伏，溫度在25℃左右，檢測(cè)器以紫外檢測(cè)器為主。

1.2 等速電泳

等速電泳是基于離子淌度差異的一種電泳富集模型，又被稱(chēng)為“移動(dòng)邊界”電泳技術(shù)。其樣品在前導(dǎo)和尾隨電解質(zhì)之間被注入。在高電壓的作用下各組分會(huì)逐漸分離，隨著組分的分離各組分區(qū)帶的電場(chǎng)也在發(fā)生著相應(yīng)的變化。電導(dǎo)較大的離子電泳遷移速率也較大，但區(qū)帶的電場(chǎng)反而較小，其遷移速率就會(huì)逐漸降低。當(dāng)各組分的電泳遷移速率均達(dá)到前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移速率相同時(shí)達(dá)到平衡狀態(tài)，此時(shí)溶液出現(xiàn)穩(wěn)態(tài)遷移模式。等速電泳的負(fù)載量進(jìn)樣量比毛細(xì)管區(qū)帶電泳高很多，可達(dá)μL級(jí)。等速電泳對(duì)痕量樣品起到很好的濃縮作用，是一種理想的樣品富集技術(shù)。等速電泳非常適用于血樣、尿樣以及環(huán)境樣品等復(fù)雜樣品基質(zhì)的生物樣品體系，應(yīng)用范圍包括荷電小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子。

1.3 色譜富集

固相萃取富集是一種離線(xiàn)樣品前處理方法，在毛細(xì)管電泳分離中經(jīng)常使用。該方法是毛細(xì)管電泳在線(xiàn)富集的一種新手段，實(shí)際上就是在毛細(xì)管柱上進(jìn)行色譜富集。其富集的過(guò)程是先將量比較大的低濃度樣品負(fù)載到固定相中，再用體積相對(duì)較小的洗脫液將樣品洗脫下來(lái)，從而得到濃度較高的富集溶液。在分析工作中常見(jiàn)的與毛細(xì)管在線(xiàn)聯(lián)用的方法有固相萃取、膜萃取和液相萃取等。但色譜富集方法的缺點(diǎn)是操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、自動(dòng)化程度低。

1.4 樣品堆積

在高電壓的作用下，若毛細(xì)管中同時(shí)存在著低導(dǎo)和高導(dǎo)溶液時(shí),低導(dǎo)溶液區(qū)的電場(chǎng)要比高導(dǎo)溶液區(qū)的電場(chǎng)強(qiáng)度高，低導(dǎo)區(qū)的樣品離子遷移速度要比高導(dǎo)區(qū)的樣品離子遷移速度快。樣品堆積技術(shù)就是利用了這個(gè)速度的差別。該方法先將待測(cè)樣品溶解于低導(dǎo)溶液中，在高電壓作用下毛細(xì)管中的樣品離子向高導(dǎo)的緩沖溶液中運(yùn)行。樣品離子在越過(guò)低導(dǎo)溶液和高導(dǎo)緩沖液交界面時(shí)，遷移速度會(huì)大幅度的降低,樣品離子速度驟降的結(jié)果導(dǎo)致了樣品區(qū)帶長(zhǎng)度的縮短，濃度則相應(yīng)提高，從而達(dá)到富集目的。

毛細(xì)管電泳在線(xiàn)富集方法中樣品堆積方法是應(yīng)用較為廣泛的方法之一，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于陰、陽(yáng)離子和混合離子的分離分析。目前主要有壓力進(jìn)樣和電動(dòng)進(jìn)樣兩種樣品堆積方法。采用電動(dòng)進(jìn)樣的樣品堆積又被稱(chēng)為場(chǎng)放大進(jìn)樣，電動(dòng)進(jìn)樣是一種更高效的在線(xiàn)富集方法，具有比壓力進(jìn)樣更高的濃度檢測(cè)靈敏度。

1.5 pH法

常見(jiàn)的pH法有pH調(diào)制堆積和動(dòng)態(tài)pH聯(lián)接。pH調(diào)制堆積中的酸富集是將樣品用高離子強(qiáng)度的溶液制備并通過(guò)電遷移引入毛細(xì)管，然后通過(guò)電遷移引入一小段強(qiáng)酸溶液。強(qiáng)酸中的質(zhì)子在電動(dòng)進(jìn)樣時(shí)快速地向樣品區(qū)帶遷移，中和了其中的弱酸根離子，使待測(cè)組分變?yōu)殡娭行?，?dǎo)致電中性樣品區(qū)帶的電導(dǎo)率大大降低，使得待測(cè)組分在樣品區(qū)帶與背景緩沖溶液的界面處進(jìn)行堆積，樣品區(qū)帶縮短，樣品濃度增加，從而使靈敏度顯著提高，可以用于高鹽基質(zhì)中痕組分的分析。但毛細(xì)管大部分長(zhǎng)度用于富集了，用于分離的長(zhǎng)度僅占一小部分，會(huì)嚴(yán)重影響方法的分離能力。該法對(duì)于復(fù)雜組分樣品的測(cè)試不利，但非常適合組分簡(jiǎn)單的樣品中的痕量組分分析。

1.6 絡(luò)合平衡富集法

金屬離子在進(jìn)入流動(dòng)相時(shí)，會(huì)與其中的絡(luò)合劑發(fā)生絡(luò)合使離子的遷移狀態(tài)發(fā)生驟變而實(shí)現(xiàn)離子的富集[10]。在樣品區(qū)帶前端樣品溶液中的金屬離子遷移到初始樣品區(qū)段與運(yùn)行區(qū)段的邊沿時(shí)，與流動(dòng)相中的絡(luò)合劑絡(luò)合，原來(lái)帶正電的離子變?yōu)橹行曰驇ж?fù)電，電泳遷移速率會(huì)明顯降低或改變遷移方向；而樣品區(qū)帶后端的帶正電荷金屬離子繼續(xù)遷移，在遇到帶負(fù)電荷的絡(luò)合劑離子后發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，在兩相界面堆積從而達(dá)到富集的目的。

2 試驗(yàn)

2.1 試驗(yàn)器材

毛細(xì)管電泳儀：型號(hào)Beckman P/ACE System 5010，生產(chǎn)商：美國(guó)Beckman公司；熔融石英毛細(xì)管50μm，生產(chǎn)商：河北永年光導(dǎo)纖維廠(chǎng)。咪唑(分析純);α-羥基乙酸(分析純);其他有關(guān)試劑均為分析純。

2.2 儀器測(cè)驗(yàn)條件

紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；試驗(yàn)溫度：25℃；電泳電壓：20kV；采集頻率：16Hz。

毛細(xì)管使用前以1mol/L NaOH溶液、純凈水、緩沖液分別依次沖洗3min。

清洗液：0.1mol/LHCl溶液；0.1mol/LNaOH溶液；純凈水；背景電解質(zhì)：咪唑溶液(10mmol/L)， α-羥基乙酸(10mmol/L)；pH=4.0。

3 結(jié)果與討論

使用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法對(duì)食品中常見(jiàn)的一些指標(biāo)元素進(jìn)行了探索分析, 發(fā)現(xiàn)背景電解質(zhì)和緩沖液pH值對(duì)離子間的分離影響較大。咪唑濃度的增加與離子分離效果成正比，但增強(qiáng)的背景吸收會(huì)掩蓋離子峰的強(qiáng)度，如果咪唑濃度過(guò)高會(huì)影響方法的靈敏度。pH值明顯影響配位平衡，pH值的增加會(huì)導(dǎo)致各離子峰的區(qū)分度變差，主要原因是pH值的增加增大了電滲流。增大α-羥基乙酸濃度會(huì)增加各離子峰的遷移時(shí)間，但太低的濃度不利于各離子峰的區(qū)分。實(shí)驗(yàn)條件需要針對(duì)具體情況綜合優(yōu)化，綜合優(yōu)化條件下3種食品中作為重要指標(biāo)元素的金屬離子的毛細(xì)管電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 3種金屬離子電泳圖

對(duì)于圖1測(cè)定的3種金屬離子，測(cè)試結(jié)果給出的檢出限分別為：Cd2+：0.02μg/mL；Pb2+：0.07μg/mL；Cu2+：0.05μg/mL。

根據(jù)試驗(yàn)得出的線(xiàn)性回歸方程，得到3種金屬離子在CZE測(cè)定中的線(xiàn)性范圍為：Cd2+：0.05～20μg/mL；Pb2+：0.12～20μg/mL；Cu2+：0.10～25μg/mL。

精密度試驗(yàn)給出，在10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合液情況下，3種金屬離子的 RSD(%)(n=7)分別為：Cd2+：2.1；Pb2+：1.1；Cu2+：1.6。

咪唑溶液濃度加大對(duì)分離有利，但濃度的增加會(huì)使背景吸收加強(qiáng)，有時(shí)會(huì)降低方法的靈敏度，對(duì)檢出限不利。α-羥基乙酸溶液濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響明顯，濃度太高使遷移時(shí)間明顯增加并產(chǎn)生較高的焦耳熱，濃度太低會(huì)使各離子峰展寬而區(qū)分度變壞。pH值的升高也會(huì)使離子峰的區(qū)分度變差，主要是電滲流會(huì)隨著pH值的升高而增大。

4 結(jié)語(yǔ)

毛細(xì)管電泳是近三十年發(fā)展起來(lái)的一種新型富集分離分析技術(shù)，是分析科學(xué)領(lǐng)域繼高效液相色譜之后的又一次革命，是現(xiàn)代微柱分離與經(jīng)典電泳技術(shù)有機(jī)的結(jié)合。

背景電解質(zhì)選用10mmol/L咪唑溶液，陽(yáng)離子的選擇性改性劑使用10mmol/L的α-羥基乙酸作為，電泳條件選擇pH=4.0、分離電壓20kV、分離溫度25℃。幾種金屬離子在15min內(nèi)可得到有效分離，且具有較低的檢出限和良好的線(xiàn)性關(guān)系。

利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法,選用適合的背景電解質(zhì)和選擇性改性劑,在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下可以有效解決目前食品衛(wèi)生等領(lǐng)域痕量元素分析的需求。