西番蓮組織培養(yǎng)技術(shù)研究

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(1.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室， 云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室， 昆明 650224)

西番蓮(PassifloraedulisSims)又稱百香果、雞蛋果、熱情之果，原產(chǎn)南美洲的巴西至阿根廷一帶，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]，是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(PassifloraL.)的多年生常綠藤本植物，有“果汁之王”的美譽。西番蓮集果用、藥用、油用和綠化觀賞為一體，經(jīng)濟價值非常高。它的果實中富含類胡蘿卜素、還原糖、多種維生素、蛋白質(zhì)、人體所需的17種氨基酸及大量微量元素等，具有消除疲勞、美容養(yǎng)顏、抑菌抗癌及降低膽固醇等多種保健療效[2-4]，可作水果鮮食。另外，因果汁風(fēng)味獨特，口感香甜，素有“果汁之王”的美譽，所以果實多用于加工成飲料及口服液等[5]。近年來世界各地對西番蓮果汁需求日益增多，西番蓮生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，生產(chǎn)發(fā)展迅速[6]。我國種植業(yè)起步相對較晚，西番蓮擴繁主要采用實生苗與蔓條扦插繁殖[7]，生產(chǎn)中存在較多問題，如實生苗的培育種子萌發(fā)率與成活率低，緩苗期長、抗病性低等問題；蔓條扦插繁殖若操作不當會加快品種退化、病害增加致使產(chǎn)量降低，這些問題影響和制約了西番蓮的加工與生產(chǎn)[8-11]。鑒于此，國內(nèi)外開展了西番蓮組織離體再生研究，并且已經(jīng)取得了一定的進展。通過西番蓮組織培養(yǎng)研究不僅可以進行優(yōu)良品種篩選，解決品種單一的問題，還可擴大種質(zhì)資源，并加以保護和利用。在離體器官培養(yǎng)方面，進行了莖尖、莖段、子葉、下胚軸、卷須、花粉、原生質(zhì)體[12-15]的培養(yǎng)研究，都獲得了成功，建立了高效再生體系。但是，國內(nèi)外對西番蓮組織培養(yǎng)的研究較少，其離體快繁體系也不完善。為此，建立一個快速高效的離體再生系統(tǒng)日顯重要。胚乳是天然的三倍體組織，早在20世紀30年代，科學(xué)家們就開展了胚乳培養(yǎng)研究，由胚乳培養(yǎng)獲得三倍體再生植株，就有可能因此建立起三倍體新類型，產(chǎn)生無籽果實，從生產(chǎn)的角度看，無籽果實較受歡迎，人們對胚乳培養(yǎng)一直較為青睞[16-18]。因此，果樹胚乳培養(yǎng)不僅具有理論價值，而且有應(yīng)用前景。本試驗以莖段、胚乳作外植體，利用西番蓮植株的莖段進行腋芽與愈傷誘導(dǎo)，同期進行胚乳的愈傷誘導(dǎo)，對西番蓮的快繁體技術(shù)進行研究，以期為今后西番蓮的選育及綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的西番蓮?fù)庵搀w滅菌材料均取自西南林業(yè)大學(xué)內(nèi)苗圃。選取當年新抽、無病蟲為害、生長健壯的嫩枝9～10個節(jié)。

在選取的外植體滅菌試驗材料中，以帶節(jié)莖段作為無菌芽誘導(dǎo)的材料，以無節(jié)莖段與胚乳作為愈傷組織誘導(dǎo)的材料。

1.2 方 法

將取回的嫩枝用自來水沖洗干凈，然后用流水沖洗30 min，將沖洗好的材料置于超凈工作臺上。用濃硫酸浸泡西番蓮種子至即將破裂為止。將處理過的西番蓮帶殼種子與沖洗好的莖段先用70%酒精消毒30 s，然后用0.1%升汞(HgCl2)滅菌8 min。滅菌過程中要不斷地搖晃滅菌瓶，保證滅菌劑全面浸透外植體，滅菌完畢后用無菌水沖洗外植體3～5次，每次間隔1～2 min，最后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分。

1.3 接種培養(yǎng)基

莖段培養(yǎng)中將莖段切成長約8 mm的帶芽或無芽莖段培養(yǎng)。胚乳培養(yǎng)需在超凈臺上將種子縱剖為兩半，剝?nèi)シN殼，取出胚乳后一半剔除胚，一半保留胚，將帶胚胚乳與不帶胚胚乳分開接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。西番蓮?fù)庵搀w芽的誘導(dǎo)、愈傷組織的誘導(dǎo)及分化、芽的繼代增殖均以MS為基本培養(yǎng)基，附加細胞分裂素6-BA和生長素NAA、IBA。在1.41 kg/cm2的飽和蒸汽條件下滅菌21 mm。不同濃度的6-BA和NAA、IBA配合組成培養(yǎng)基系列(表1)和不同濃度的蔗糖，0.7%瓊脂，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強度1 500～1 800 lx、置于光照時間12 h的培養(yǎng)室中置架培養(yǎng)。

表1 莖段培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方

處理號培養(yǎng)基配方J1MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAAJ2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LIBAJ3MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LIBAJ4MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LIAA

表2 胚乳誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基配方

處理號培養(yǎng)基配方P1MS+1.0mg/L6-BA+0.025mg/LNAAP2MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAAP3MS+1.0mg/L6-BA+0.075mg/LNAAP4MS+1.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA

1.4 生理指標測定

完成外植體滅菌接種工作后，隨時對培養(yǎng)過程中外植體的顏色和形態(tài)變化進行觀察和記錄；第10天統(tǒng)計不同處理的污染情況并計算污染率；第20天統(tǒng)計無節(jié)莖段等外植體的出愈情況，計算誘導(dǎo)率；第30天統(tǒng)計不同處理的芽誘導(dǎo)情況、苗的生長狀況等，計算出芽誘導(dǎo)率；并觀察苗的長勢，有關(guān)統(tǒng)計指標如下。

菌污染率(%)=菌污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；

芽誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

死亡率(%)=死亡的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；用Excel 2003軟件進行圖表分析。

表3 不同培養(yǎng)基配方對莖段培養(yǎng)的影響

處理號接種數(shù)(個)菌污染率(%)死亡率(%)誘導(dǎo)率(%)芽誘導(dǎo)率(%)顏色與大小質(zhì)地J11833.3316.6733.3327.78淺綠色,質(zhì)地較密實,愈傷組織較小,腋芽較小呈翠綠色J21822.2216.6727.7844.44淺綠色,質(zhì)地較松軟,愈傷組織中等,腋芽中等呈翠綠色J31816.6711.1166.6744.44淺綠色,質(zhì)地較松軟,愈傷組織較大,腋芽較大呈翠綠色J41822.2222.2255.5655.56淺綠色,質(zhì)地較密實,愈傷組織中等,腋芽較大呈嫩綠色

表4 不同培養(yǎng)基配方對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響

處理號接種數(shù)(個)菌污染率(%)死亡率(%)誘導(dǎo)率(%)芽誘導(dǎo)率(%)顏色與大小質(zhì)地P112046.6700均無愈傷組織,部分有褐化現(xiàn)象P21202516.6716.67帶胚胚乳:翠綠色,質(zhì)地較松軟,愈傷組織較大,不定芽叢生,部分也出現(xiàn)有褐化現(xiàn)象無胚胚乳:無愈傷組織,部分有褐化現(xiàn)象P31205000均無愈傷組織,部分有褐化現(xiàn)象P412046.6700均無愈傷組織,部分有褐化現(xiàn)象

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方對莖段培養(yǎng)的影響

莖段培養(yǎng)的外植體接種1周左右開始膨大，形態(tài)學(xué)上端較形態(tài)學(xué)下端先產(chǎn)生愈傷組織。帶節(jié)的莖段在莖節(jié)處極易出芽，無節(jié)莖段在切口處形成綠色、瘤狀愈傷組織，經(jīng)一段時間培養(yǎng)后從愈傷組織上形成綠色芽點而后叢生出多個細長的不定芽，成熟植株帶芽莖段經(jīng)培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)腋芽生長獲得無性系材料。由表3可知，J 3、J 4誘導(dǎo)率與芽誘導(dǎo)率達最高。

J 3的誘導(dǎo)率與芽誘導(dǎo)率分別為66.67%與55.56%，J 4的誘導(dǎo)率與芽誘導(dǎo)率分別為55.56%與44.44%，J 3略高于J 4，莖段在MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA上，分化率達到最高。J 3配方芽生長正常，快速，畸形苗少(圖1)。且J 3的死亡率在4個培養(yǎng)基配方里最小。

2.2 不同培養(yǎng)基配方對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4可看出，僅有P 2(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA)組合中帶胚胚乳在胚與胚乳間有愈傷組織產(chǎn)生，愈傷組織呈翠綠色，面積較大，質(zhì)地松軟，其它組合培養(yǎng)基中的胚乳無變化或由剛接入的嫩白色漸漸褐化死亡。

在胚乳誘導(dǎo)出愈傷組織后，將胚從胚乳中剝離出來，觀察發(fā)現(xiàn)，愈傷組織與不定芽都由胚乳誘導(dǎo)出，胚可以輕易地剝離，上面也并未有愈傷組織產(chǎn)生。P 2培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織體積較大，顏色為嫩綠色，質(zhì)地疏松并有不定芽產(chǎn)生(圖2)。因此，從誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率、質(zhì)地及是否便于操作等方面綜合考慮，認為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基在試驗條件下最適宜誘導(dǎo)西番蓮胚乳愈傷組織。

圖1 1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基的莖段培養(yǎng)

圖2 1.0 mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)的胚乳愈傷組織

3 討 論

近些年來，植株的胚乳培養(yǎng)引起了眾多研究者的注意，因培養(yǎng)胚乳和胚乳植株產(chǎn)生無籽果實用于經(jīng)濟作物上有很高的利用價值，并有可能為育種工作提供三倍體和多倍體的育種方法和原始材料。以往三倍體育種的常規(guī)方法是先誘導(dǎo)四倍體植株，待其開花后再與二倍體品種雜交[19]，不僅需時長，三倍體的獲得率也很低，僅占10%[4]，出現(xiàn)的植株多為非整倍體植株及遺傳性狀不良的個體。因此通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株改良品種，是育種工作中的一條新途徑，在理論和實踐上具有重大意義。由于胚乳的生理活性十分微弱，所以胚乳的愈傷組織誘導(dǎo)比較困難，有關(guān)西番蓮胚乳培養(yǎng)的報道較少，僅張琴等[15]在2000年進行過西番蓮胚乳培養(yǎng)。

本試驗對已有的西番蓮組織培養(yǎng)進行研究，利用莖段與胚乳進行培養(yǎng)。由于西番蓮種子種殼較厚，表面有角質(zhì)化外殼，接種時不易剖開，試驗中利用濃硫酸浸泡使其種殼變薄，既解決了不帶殼消毒損傷種子的問題，又解決了種殼過硬不易剖開的問題。利用西番蓮嫩莖進行腋芽與愈傷組織誘導(dǎo)，在已有西番蓮莖段愈傷組織誘導(dǎo)研究的基礎(chǔ)上挑選效果較好的4個配方進行對比，在莖段培養(yǎng)的4個配方中均有愈傷組織產(chǎn)生，MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基中，愈傷組織產(chǎn)生率是最高的，達到66.67%，愈傷組織質(zhì)地松軟，顏色翠綠。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IAA中愈傷組織產(chǎn)生率為55.56%，芽誘導(dǎo)率為55.56%，說明配方MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA有利于愈傷組織的形成，而MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IAA則有利于有節(jié)莖段的腋芽發(fā)育。

在對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)時，只有MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基中有愈傷組織產(chǎn)生，表明愈傷組織的產(chǎn)生并不隨激素濃度的增高而增多，只有適宜的激素濃度才有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。生長素和細胞分裂素作為植物生長調(diào)節(jié)劑，兩者的配比是誘導(dǎo)愈傷組織形成極為重要的因素。西番蓮莖段與胚乳的愈傷組織誘導(dǎo)中所需要添加的激素為6-BA和IBA、NAA，誘導(dǎo)率為66.67%與16.67%。植株部位不同，激素含量不同，愈傷組織誘導(dǎo)時所需激素配方也不相同。觀察誘導(dǎo)出愈傷組織的胚乳，都為帶有胚的胚乳。通常帶胚比不帶胚的胚乳更容易形成愈傷組織，尤其是用干種子的胚乳培養(yǎng)時，由于胚乳的生理活性十分微弱，在誘導(dǎo)其脫分化前，必須借助原位胚的萌發(fā)使其活化[20]，這與試驗結(jié)果一致。本試驗通過對西番蓮莖段培養(yǎng)及胚乳愈傷組織誘導(dǎo)進行了一些基礎(chǔ)研究，希望為進一步研究西番蓮離體再生提供參考。