近年來,國內(nèi)外研究者針對人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow strom al cells,HBMSCs)向神經(jīng)細(xì)胞系分化的體內(nèi)外誘導(dǎo)移植實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均證實(shí)干細(xì)胞移植治療的可行性。2017年新的實(shí)驗(yàn)研究MASTERSⅡ期臨床實(shí)驗(yàn)研究對發(fā)病后24 h~36 h接受干細(xì)胞移植治療的病人隨訪1年,實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示干細(xì)胞移植治療的病人存在臨床獲益。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步為急性缺血性腦損傷的干細(xì)胞移植臨床治療提供了確切的依據(jù),成為2017年神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域新的成就與突破點(diǎn),為降低急性缺血性腦損傷致殘率,減輕致殘后社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)帶來了新的曙光。干細(xì)胞移植治療,關(guān)鍵在于干細(xì)胞體外培養(yǎng)分化的滿意度,是移植治療的前提,因此干細(xì)胞研究者們對于HBMSCs體外誘導(dǎo)分化的最佳因子、外部條件影響因素的探索試驗(yàn)尤其重視和期盼。目前體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究主要為使用各種外來因子、化學(xué)試劑對HBMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)調(diào)控,例如:國內(nèi)學(xué)者臨床治療急性腦梗死應(yīng)用清除自由基劑依達(dá)拉奉、丁苯酞,以及神經(jīng)修護(hù)因子神經(jīng)節(jié)苷脂、胞二磷膽堿及神經(jīng)生長促進(jìn)劑葉酸、甲鈷胺等,還有中藥制劑丹參、銀杏葉、紅花、黃芪等作為誘導(dǎo)劑[1-2]。
還原型谷胱甘肽(reduced glutathione GSH)是谷胱甘肽在體內(nèi)的氧化活性成分,多項(xiàng)研究均提示GSH具有抗炎、抗氧化、清除自由基等細(xì)胞保護(hù)作用。在臨床多用于急性肝損傷、腎臟損傷的治療。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)GSH在預(yù)防血管性認(rèn)知障礙、帕金森等領(lǐng)域有較顯著的治療效果。GSH和維生素C(vitamin C,VC)液均為體內(nèi)主要的自由基清除劑,GSH的作用主要是使其巰基-SH氧化,而VC能夠維持活性成分巰基-SH處于還原狀態(tài),進(jìn)一步影響細(xì)胞的代謝過程。王蘭等[3]研究證實(shí)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以在GSH作用下成功誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)mRNA的表達(dá)。本研究擬通過GSH聯(lián)合VC液共同作用下骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn),觀察VC液是否可以促進(jìn)GSH發(fā)揮抗氧化神經(jīng)保護(hù)作用,進(jìn)一步探討GSH、VC液對HBMSCs體外誘導(dǎo)的作用機(jī)制。
1.1 干細(xì)胞來源 門診健康志愿者。
1.2 主要試劑 GSH(上海復(fù)旦夏華藥業(yè)股份有限公司),L-DMEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生物制劑公司),VC液(北京雙鶴藥業(yè)有限公司),胎牛血清(北京普利萊生物有限公司),羊抗小鼠二抗(天津景晨生物制品公司),谷氨酰胺(武漢普諾賽生物制劑公司),EDTA(天津景晨生物制品有限公司),甲基亞砜(DMSO,武漢普諾賽生物制劑公司),小鼠抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)單抗(Chemical公司),GFAP單抗(Chemical公司)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 HBMSCs分離與培養(yǎng) 穿刺取健康志愿者骨髓4 mL并肝素化,均分至50 mL培養(yǎng)瓶。加入培養(yǎng)基搖勻,培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng),每3 d換液1次,待細(xì)胞至90%以上融合時(shí)準(zhǔn)備傳代。顯微鏡下觀察,細(xì)胞體開始回縮后終止消化。用吸管輕輕反復(fù)吹打瓶底至細(xì)胞完全脫落,按1∶3分瓶培養(yǎng)。取第5代細(xì)胞,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗制成單細(xì)胞PBS懸液300 μL,均分至5只Ef管,每份標(biāo)本計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞,取四管,一管做空白對照,余三管依次加入CD90、CD45、CD105。4 ℃,避光,培育30 min。PBS沖洗1遍,放入冰盒,避光,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果取3次均值。
1.3.2 HBMSCs的體外誘導(dǎo)分化 取第5代HBMSCs,接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)成單層細(xì)胞后進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)。培養(yǎng)液仍為L-DMEM,分4組,每組均以1 mmol/L BME作為預(yù)誘導(dǎo)液預(yù)處理24 h。更換培養(yǎng)液,并PBS洗滌3次,以DMSO+BHA+DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)作為對照組。在此基礎(chǔ)上分別加入10 mmol/L GSH 10 μL、VC液、GSH+VC液10 μL誘導(dǎo)液處理進(jìn)行誘導(dǎo)分化,作為GSH組、VC液組、GSH+VC組。
1.3.3 免疫組化法鑒定及計(jì)數(shù)細(xì)胞 預(yù)制備細(xì)胞爬片后取出蓋玻片,用4%多聚甲醛固定30 min,蒸餾水洗滌,干燥后加入0.5%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min,PBS洗滌,5%正常羊血清封閉20 min,分別加入含抗NSE、GFAP單克隆抗體作為第一抗體。37 ℃反應(yīng)1 h,PBS洗滌3次。滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG,37 ℃反應(yīng)20 min,PBS洗滌3次,加入鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑,37 ℃反應(yīng)20 min,PBS 洗滌4次。最后用新配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液在室溫反應(yīng)5 min~30 min,顯微鏡下監(jiān)測其顏色變化,陰性對照不加一抗。細(xì)胞分化率計(jì)算公式:(NSE+GFAP)陽性染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。
2.1 HBMSCs的分離與擴(kuò)增 接種后24 h顯微鏡觀察,少許細(xì)胞貼壁,多為橢圓形,成對出現(xiàn),折光性強(qiáng)。繼續(xù)培養(yǎng)2 d~3 d,可見少數(shù)多邊形、梭形細(xì)胞,個(gè)別胞體見不同方向細(xì)胞突起。5 d后胞體進(jìn)一步增大,第8天可見集落生長的細(xì)胞群。進(jìn)行傳代后第2天細(xì)胞即貼壁生長,5 d左右即鋪滿瓶底,5代的細(xì)胞形態(tài)比較均一。
2.2 流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果、細(xì)胞形態(tài)變化 HBMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀測定表面標(biāo)記結(jié)果為CD90(+)、CD105(+)、CD45(-),表明細(xì)胞純度相對較高。經(jīng)GSH、VC液及兩者混合液分別誘導(dǎo)分化后14 h,每組細(xì)胞胞體均成圓形分化,并有局部胞體不同程度突起,隨著時(shí)間延長突起變多變長,并相互連接交織成網(wǎng)。
2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定及分化細(xì)胞的計(jì)數(shù) 誘導(dǎo)分化后14 h,每組細(xì)胞胞體均成圓形分化,并有局部包體不同程度突起,折光性強(qiáng);誘導(dǎo)后24 h行細(xì)胞免疫化學(xué)顯示,對照組、VC液組以GFAP陽性為主;GSH組、GSH+VC組以NSE陽性為主。GSH+VC組NSE、GFAP陽性表達(dá)率與GSH組、VC液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。
表1 HBMSCs誘導(dǎo)分化后神經(jīng)性細(xì)胞特異性抗原表達(dá)率(±s) %
目前腦卒中的治療多限于急性期靜脈溶栓、靜脈動脈橋接治療及丁苯酞、尤瑞克林側(cè)支循環(huán)的改善,以及其他腦保護(hù)及清除自由基等治療。國內(nèi)外研究者已經(jīng)證實(shí)在大鼠腦缺血后數(shù)小時(shí)HBMSCs 移植治療即可挽救缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的代謝、清除自由基,使神經(jīng)功能不同程度改善[4-6]。移植治療HBMSCs后組織冰凍切片及磁共振磁共振彌散成像(DWI)與增強(qiáng)灌注成像(PWI)均顯示細(xì)胞損傷明顯減輕[7-9]。HBMSCs 這些積極的作用機(jī)制包括神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用,二級、三級新生血管生成,神經(jīng)元再生和軸突發(fā)芽、樹突再生[4,10-11]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GSH、VC液及其混合液均能促進(jìn)HBMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞增殖傳代及分化,其中GSH+VC組增殖分化較為理想,明顯高于GSH組、VC液組。提示GSH在適當(dāng)劑量VC液的誘導(dǎo)下對神經(jīng)細(xì)胞分化的影響較單一GSH誘導(dǎo)分化效果更佳,證實(shí)了VC可以促進(jìn)GSH清除自由基、神經(jīng)保護(hù)等作用。目前因?yàn)槲覈P(guān)于急性卒中腦梗死病人院前宣傳效果不佳,很多病人發(fā)生急性神經(jīng)缺失癥狀后就診時(shí)大部分已錯(cuò)過急性靜脈溶栓時(shí)間,甚至錯(cuò)過動脈橋接時(shí)間,很多病人只能進(jìn)行靜脈營養(yǎng)治療,因此對諸多神經(jīng)保護(hù)劑療效的探索尤為重要,本實(shí)驗(yàn)旨在為GSH臨床治療中改善病人神經(jīng)缺失癥狀提供更多依據(jù),可以適量GSH、VC聯(lián)用發(fā)揮更好療效。