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    活血化痰方對(duì)慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能及腦ChAT、NCAM的影響

    2018-08-14 06:56:12,,,
    關(guān)鍵詞:水平功能實(shí)驗(yàn)

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    慢性腦缺血(chronic cerebal hyoperfusion,CCH)是臨床常見(jiàn)的腦血管病癥的病理狀態(tài),多以腦動(dòng)脈硬化引起的長(zhǎng)期慢性腦血流灌注不足為特征,可致腦組織損傷,進(jìn)而造成認(rèn)知功能損害[1]。本課題組自制活血化痰方,由石菖蒲、毛冬青、膽南星、全蝎、川芎等中藥材組成,具有活血化痰通絡(luò)之功效?;钛捣绞潜驹褐嗅t(yī)內(nèi)科治療腦缺血及其并發(fā)癥血管性認(rèn)知障礙的經(jīng)驗(yàn)方。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)[2],活血化痰方能改善非癡呆型血管性認(rèn)知功能障礙病人的認(rèn)知功能。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎手術(shù)制作的大鼠慢性腦缺血模型,觀察其認(rèn)知功能損害及腦組織內(nèi)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(cholineacetyltrans ferase,ChAT)、神經(jīng)細(xì)胞黏附因子(neural cell adhension molecule,NCAM)的變化情況,以及活血化痰方對(duì)慢性腦缺血大鼠的干預(yù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 藥品及試劑 活血化痰方(組方為石菖蒲、毛冬青、膽南星、全蝎、川芎等),由上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院藥劑科加工并提供,按水煎濃縮至每毫升藥液含生藥1.5 g。ChAT試劑盒(南京建成生物工程有限公司);NCAM試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

    1.2.1 動(dòng)物及分組 本研究共使用12周齡的SPF級(jí)的SD雄性大鼠28只,體重在250 g左右,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、治療組,每組7只。治療組中藥按生藥15 g/kg劑量進(jìn)行灌胃,其余3組則以蒸餾水灌胃,持續(xù)4周。

    1.2.2 腦缺血模型制作 選用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的大鼠腦缺血模型。具體方法為腹腔注射水合氯醛麻醉SD大鼠,然后將大鼠固定于操作臺(tái),進(jìn)行常規(guī)消毒后切開(kāi)皮膚并分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid arteries,CCA)。模型組及治療組大鼠首先腹腔注射硝普鈉(北京制藥工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)藥廠,2.5 mg/kg),接著用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA,10 min后,再通10 min,再夾閉10 min,然后以4號(hào)手術(shù)線雙結(jié)扎頸總動(dòng)脈,于兩端結(jié)扎線間剪斷動(dòng)脈,再縫合傷口,放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與模型組相同,但不結(jié)扎頸總動(dòng)脈及注射硝普鈉。在手術(shù)過(guò)程中,所有動(dòng)物直腸溫度均應(yīng)該保持在37 ℃左右,以防止低溫對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用。

    1.3 認(rèn)知功能檢測(cè) 大鼠的認(rèn)知功能檢查采用常用Morris水迷宮法。通過(guò)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation)來(lái)評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)能力;以空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe)檢測(cè)大鼠的記憶能力。自制一個(gè)直徑為130 cm、高50 cm的圓柱形池子,在其中注入約30 cm深的蒸餾水,溫度大約在26 ℃。在給藥后4周,對(duì)所有大鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索。

    1.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 研究在每天09:00和14:00兩個(gè)時(shí)段進(jìn)行,持續(xù)進(jìn)行4 d。每次實(shí)驗(yàn)中訓(xùn)練大鼠4次,先讓大鼠在池子中游泳2 min,以適應(yīng)水迷宮環(huán)境。在水池NW象限中設(shè)置一個(gè)平臺(tái),將實(shí)驗(yàn)大鼠于池周不同象限作為起始點(diǎn)依次放入水中,然后觀察并記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)和路線。在實(shí)驗(yàn)中大鼠找到平臺(tái)5 s后終止記錄,最長(zhǎng)記錄時(shí)間為120 s。如果超過(guò)120 s,大鼠也不能找到平臺(tái),則引導(dǎo)其爬上平臺(tái),休息約10 s,再進(jìn)行一次試驗(yàn)。每只大鼠每天觀察并記錄4次潛伏期,以其均值為大鼠最終學(xué)習(xí)成績(jī)。

    1.3.2 空間探索試驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)完成后撤除水池中的平臺(tái)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠在同一個(gè)入水點(diǎn)放入水中,然后觀察并記錄大鼠在2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù),計(jì)算平均成績(jī)。

    1.4 ChAT和NCAM的測(cè)定 在成模4周后頸椎脫臼處死大鼠以測(cè)定ChAT和NCAM的含量,分別取額葉皮層、海馬、伏隔核的腦組織為標(biāo)本,剪碎標(biāo)本置入玻璃勻漿管中,加入冷生理鹽水制成勻漿液,進(jìn)行ChAT和NCAM含量的測(cè)定,操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

    2 結(jié) 果

    2.1 大鼠認(rèn)知功能檢測(cè)結(jié)果 第4周對(duì)大鼠的認(rèn)知功能觀察發(fā)現(xiàn),模型組定位航行實(shí)驗(yàn)的潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組及假手術(shù)組(P<0.01),但治療組潛伏期明顯短于模型組(P<0.01);模型組空間探索試驗(yàn)的跨越平臺(tái)次數(shù)明顯少于對(duì)照組及假手術(shù)組(P<0.01),而治療組跨越平臺(tái)次數(shù)明顯多于模型組(P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

    表1 活血化痰方對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響(±s)

    2.2 大鼠腦組織ChAT和NCAM的測(cè)定結(jié)果 模型組腦組織中ChAT水平低于對(duì)照組及假手術(shù)組(P<0.01),而治療組ChAT水平高于模型組(P<0.01),但是低于對(duì)照組及假手術(shù)組(P<0.051);模型組NCAM水平高于對(duì)照組及假手術(shù)組(P<0.01),而治療組NCAM水平低于模型組(P<0.01),但高于對(duì)照組及假手術(shù)組(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

    表2 活血化痰方對(duì)血管性認(rèn)知障礙大鼠腦組織ChAT和NCAM的影響(±s)

    3 討 論

    以雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎手術(shù)制作的大鼠慢性腦缺血模型,手術(shù)方法簡(jiǎn)單,可重復(fù)性好,模型成功率高,動(dòng)物死亡率低。有研究表明,雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)所致大鼠腦缺血模型可以造成大鼠腦部血流量呈現(xiàn)慢性且持續(xù)性下降[3]。相關(guān)文獻(xiàn)指出由于大鼠腦部海馬、皮質(zhì)等對(duì)認(rèn)知功能相關(guān)區(qū)域腦血流量明顯降低,發(fā)生慢性腦缺血,使相關(guān)區(qū)域神經(jīng)元損害逐漸加重,從而產(chǎn)生明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙[4]。所以目前本模型已經(jīng)成為血管性認(rèn)知障礙方面動(dòng)物研究最常用的造模方法。

    認(rèn)知功能是大腦的高級(jí)生理功能,海馬、額葉、基底前腦是產(chǎn)生學(xué)習(xí)與記憶的主要功能部位,膽堿能系統(tǒng)是產(chǎn)生認(rèn)知功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。其中乙酰膽堿(acetylcholine,ACH)是腦部重要的神經(jīng)遞質(zhì),其對(duì)認(rèn)知功能的產(chǎn)生起到了關(guān)鍵作用。ChAT是乙酰膽堿的限速酶,其催化乙酰膽堿的合成,而乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase,AchE)是乙酰膽堿的水解酶。所以ChAT和AchE相互制約平衡,維持ACH的穩(wěn)定狀態(tài)[5]。有研究表明采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)的大鼠血管性癡呆模型,AchE水平明顯上升,而ChAT水平明顯下降,提示造模造成的腦缺血,有可能因?qū)е律窠?jīng)元損傷,從而破壞膽堿能系統(tǒng)的正常功能[6]。因而上調(diào)ChAT有助于提高ACH的表達(dá)水平,從而改善認(rèn)知能力。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明模型組大鼠ChAT水平明顯低于假手術(shù)組和對(duì)照組,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符,說(shuō)明造模后大鼠因神經(jīng)膽堿能系統(tǒng)破壞而影響了其認(rèn)知功能?;钛捣街委煹拇笫驝hAT水平高于模型組,提示活血化痰方對(duì)大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用與其升高大鼠腦ChAT水平有關(guān)。

    NCAM是免疫球蛋白超家族類(lèi)細(xì)胞黏附分子的一種,可以抑制大腦海馬前體細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)海馬前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化[7]。NCAM在大腦的認(rèn)知功能中扮演重要的角色,NCAM可以促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)元軸突、樹(shù)突的生長(zhǎng)與修復(fù),促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的重塑。在大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的研究中發(fā)現(xiàn),在腦缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)NCAM表達(dá)持續(xù)上升,提示NCAM可能參與了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程[8]。在對(duì)大鼠顱腦損傷的研究發(fā)現(xiàn),不同程度的顱腦損傷后均可以導(dǎo)致NCAM水平的明顯提高,且存在先降后升的趨勢(shì)[9]。NCAM的升高程度與顱腦損傷的程度存在相關(guān)性,并且與認(rèn)知障礙及ChAT的變化間存在一定的關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)模型組與治療組大鼠腦NCAM水平明顯高于假手術(shù)組和對(duì)照組,間接反映了腦缺血后模型組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度。治療組NCAM水平低于模型組,提示活血化痰方的干預(yù)作用使治療組腦損傷程度小于模型組。

    慢性腦缺血屬于中醫(yī)腦病范疇,但目前在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中并無(wú)對(duì)應(yīng)病癥。其臨床表現(xiàn)可以部分參考癡呆、健忘、髓消、眩暈等病癥內(nèi)容進(jìn)行辨證論治。 “痰”“瘀”“毒”是慢性腦缺血發(fā)病的主要病理因素,痰瘀內(nèi)生、痹阻腦竅、毒損腦絡(luò)是發(fā)病的重要病機(jī)?;钛捣街赜诨?、祛瘀,痰瘀化則腦絡(luò)通,腦絡(luò)通則毒自解、髓海充、神明清,諸癥緩解,達(dá)到了改善慢性腦缺血的目的。本研究提示活血化痰方治療慢性腦缺血大鼠,可以明顯減輕慢性腦缺血模型大鼠的認(rèn)知損害,其機(jī)制可能與本方提高大鼠腦ChAT及降低腦NCAM水平有關(guān)。

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