依達拉奉對高膽紅素血癥新生大鼠血清NSE的影響

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新生兒高膽紅素血癥(neonatal hyperbilirubinemia)是新生兒期常見的疾病之一。近些年其發(fā)病率高達30%～50%，占新生兒住院原因的首位[1]。如果病情重且治療不及時，可造成神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如聽力障礙、運動障礙及智力低下等，甚至死亡。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌組織細胞胞漿內(nèi)，近些年來人們逐漸認識到NSE可作為高膽紅素血癥腦損傷的早期檢測指標[2]。依達拉奉(edaravone)是一種腦保護劑，現(xiàn)已被應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中[3-4]。但依達拉奉應(yīng)用于高膽紅素血癥腦損傷的研究國內(nèi)外鮮有報道。本實驗通過觀察新生SD(sprague-dawley)大鼠高膽紅素血癥時使用依達拉奉干預(yù)后各時間點腦組織病理變化及血清中NSE水平的變化，探討依達拉奉對高膽紅素血癥新生大鼠有無神經(jīng)保護作用，為依達拉奉在新生兒高膽紅素血癥腦損傷的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 晶體膽紅素，購自美國Sigma公司；鼠NSE ELISA試劑盒，購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；依達拉奉注射液(商品名：易達生，20 mL∶30 mg)，由吉林省博大制藥有限責(zé)任公司提供。

1.2 動物分組 選擇7 d齡SD大鼠72只，將其隨機分為3組：高膽紅素血癥組、依達拉奉干預(yù)組、正常對照組，每組24只。每組又隨機分為3個亞組：12 h組、24 h組、48 h組，每個亞組8只。

1.3 動物實驗

1.3.1 膽紅素的配制 在避光條件下稱取40 mg的晶體膽紅素，立即溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中，再加入雙蒸水9 mL，用0.5 mol/L的HCl調(diào)至pH8.5，并保證于1 h內(nèi)使用。

1.3.2 新生大鼠高膽紅素血癥模型的制備 參照文獻[5]，采用腹腔注射的方法，高膽紅素血癥組以及依達拉奉干預(yù)組新生大鼠按100 μg/g的劑量注入膽紅素1次，建立高膽紅素血癥動物模型。正常對照組新生大鼠腹腔注入等體積的生理鹽水1次。依達拉奉干預(yù)組在造模后立刻給予新生大鼠依達拉奉2 mg/(kg·d)腹腔注射，持續(xù)2 d。

1.4 標本的獲取與實驗

1.4.1 血清標本 分別于各時間點用5%的水合氯醛將新生SD大鼠麻醉，行心臟采血，置于管中，離心取血清，于-80 ℃冰箱保存，隨后用酶聯(lián)免疫的方法檢測各組血清NSE水平。

1.4.2 腦組織標本 取血之后灌注生理鹽水和甲醛溶液，之后斷頭取腦組織，于10%甲醛溶液中固定1 d后石蠟包埋，行石蠟切片，置于載玻片上，HE染色，隨后封片，顯微鏡下觀察腦組織的病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織病理學(xué)觀察 正常對照組HE染色海馬區(qū)細胞排列整齊，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，無明顯細胞水腫；高膽紅素血癥組可見海馬區(qū)細胞排列略紊亂，細胞水腫明顯；依達拉奉干預(yù)組于各個時間點腦組織病理變化較高膽紅素血癥組輕。詳見圖1～圖3。

HE染色 12 h(100×) HE染色 24 h(100×) HE染色 48 h (100×)圖1 正常對照組腦組織病理學(xué)觀察

2.2 血清NSE含量 高膽紅素血癥組12 h、24 h、48 h血清NSE水平均高于依達拉奉干預(yù)組、正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；依達拉奉干預(yù)組12 h、24 h、48 h血清中NSE水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常對照組12 h、24 h、48 h血清中NSE含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組不同時間血清NSE比較(±s) ng/mL

3 討 論

NSE主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌組織細胞胞漿內(nèi)。有研究表明，血漿NSE是在非侵入條件下可量化神經(jīng)元損傷程度的實驗生物學(xué)標志物[6]。近年來，動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，NSE水平與高膽紅素血癥腦損傷密切相關(guān)[7-8]。Akman等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高膽紅素血癥聽力損傷嬰兒血清NSE水平有增高趨勢。國內(nèi)研究也認為，血清NSE可作為高膽紅素血癥腦損傷的標志物，并可判斷腦組織損傷的嚴重程度[2，10]。本實驗結(jié)果顯示，腹腔注射膽紅素造模12 h后，血清NSE水平增高，24 h、48 h進一步增高。高膽紅素血癥組12 h、24 h、48 h血清NSE水平均較正常對照組明顯增高(P<0.05)，與Bortolussi等[8]的實驗結(jié)果相符。其原因可能是高膽紅素血癥時，血清中膽紅素通過血-腦脊液屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)元腫脹、變性、壞死等，進而神經(jīng)元胞質(zhì)中表達的NSE漏出至腦脊液、血液中，隨著神經(jīng)元損傷的逐漸加重，外周NSE水平逐漸增高。

依達拉奉是一種腦組織保護劑。Itoh等[11]及Munake等[12]的研究證實依達拉奉有明確的神經(jīng)保護作用。依達拉奉的神經(jīng)保護作用可能是通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化[13]、抑制血管痙攣[14]等機制實現(xiàn)的。劉霄等[15]研究顯示，依達拉奉可減少腦缺血損傷病人血清中NSE含量，有助于腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。本實驗對24只高膽紅素血癥新生大鼠進行依達拉奉干預(yù)，發(fā)現(xiàn)干預(yù)后12 h、24 h、48 h血清NSE水平較高膽紅素血癥組明顯降低(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.05)。該實驗結(jié)果顯示，依達拉奉對高膽紅素血癥新生大鼠有腦保護作用，然而依達拉奉干預(yù)組血清NSE水平仍高于正常對照組，可能是依達拉奉干預(yù)2 d后仍有不同程度的腦損傷，尚未完全修復(fù)。

綜上所述，本實驗認為依達拉奉可以降低高膽紅素血癥新生大鼠血清NSE水平，對高膽紅素血癥新生大鼠有腦保護作用。然而依達拉奉對高膽紅素血癥腦損傷的修復(fù)機制尚不明確，依達拉奉的兒童用量、療程、不良反應(yīng)等方面尚需要進一步研究。