兔頸動脈硬化斑塊新生血管生發(fā)規(guī)律的研究

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頸動脈硬化斑塊(carotid plaque，CP)是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，動脈硬化斑塊中不穩(wěn)定斑塊破裂從而引發(fā)血栓逐漸成為急性心血管事件的首要病因[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化(AS)病人的硬化斑塊內(nèi)常出現(xiàn)新生血管，其與動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[2]。因此，斑塊新生血管已經(jīng)被公認(rèn)為易損斑塊的預(yù)測因子[3]，并成為預(yù)測心腦血管疾病包括中風(fēng)、心肌梗死和血管性死亡的重要指標(biāo)[4]。本研究探討斑塊新生血管與斑塊生長、發(fā)展的關(guān)系，為臨床有效預(yù)測和防治易損斑塊提供理論依據(jù)及評價方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 健康雄性新西蘭兔共48只(體重2.5 kg～3.0 kg)，隨機(jī)分為正常組(12只)、對照組(12只)和模型組(24只)。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，對照組、模型組均采用高脂飲食造模。

1.2 兔AS模型制備 采用150 g/d高脂飲食(膽固醇含量約1.5%)+球囊血管壁損傷方法造模。動物喂養(yǎng)1周后由耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對大白兔進(jìn)行麻醉，頸部常規(guī)皮膚消毒，沿頸動脈走行切開皮膚，分離右側(cè)頸內(nèi)動脈、頸外動脈和頸總動脈，肝素100 U/kg抗凝后，在距離頸總動脈分叉處0.5 cm處結(jié)扎頸外動脈，在結(jié)扎的近心側(cè)進(jìn)行穿刺，送入直徑2.5 mm球囊至頸總動脈，加壓4個～6個大氣壓，充盈球囊后緩慢拖動，持續(xù)0.5 min～1 min，間隔1 min重復(fù)，總共3次，使頸動脈損傷長度約3 cm；對照組只切開頸部皮膚，不進(jìn)行球囊損傷術(shù)。術(shù)后注射青霉素注射液80×104U/d，連續(xù)注射3 d。

1.3 取材及頸動脈目標(biāo)段病理學(xué)檢查 造模后4周，正常組、對照組各隨機(jī)取6只，模型組隨機(jī)取12只動物，完成超聲造影檢查后，采用氣栓法處死動物取材，剩余動物于造模8周后相同方法處死。以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)注射麻醉，麻醉成功后將兔子固定于手術(shù)臺上，于頸前正中皮膚切開3 cm～4 cm切口，充分分離顯露左、右頸總動脈，取左、右側(cè)頸動脈全長，生理鹽水沖洗后肉眼觀察頸動脈大體改變及斑塊破裂、血栓形成情況；切取頸動脈病變段，長度約3 cm，并切取相同長度的對應(yīng)左側(cè)頸動脈，4%多聚甲醛固定，常規(guī)組織塊乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色及CD31免疫組織學(xué)檢測。觀察并測量內(nèi)中膜厚度(IMT)及不同區(qū)域的組織形態(tài)學(xué)變化，采用CD31免疫組織學(xué)標(biāo)記新生血管數(shù)量及密度(MVD)。每組各選 10 張片子進(jìn)行圖像分析，測量斑塊面積占內(nèi)膜面積的百分比。

MVD計數(shù)：動脈斑塊標(biāo)本行免疫組化染色，進(jìn)行CD31標(biāo)記。參照Weidner校正方法，任何被抗體染色單個或成簇的內(nèi)皮細(xì)胞與周圍組織和細(xì)胞清楚分離的，都記為一個單一的血管，大于8個紅細(xì)胞面積的血管不予計數(shù)。先在低倍鏡下(×100)尋找組織內(nèi)微血管最多的染色區(qū)域即熱點，之后換用高倍鏡(×400)，在高倍鏡下計數(shù)微血管數(shù)目。

1.4 頸動脈超聲及超聲造影檢測

1.4.1 儀器及造影劑 美國 GE Vivid E9 超聲診斷儀及VevoVevo小動物超聲影像系統(tǒng)；GE Vivid E9 超聲診斷儀具有CPS 超聲造影軟件，15L8W線陣探頭，頻率為8 MHz～14 MHz。三維超聲探頭BL433，頻率4 MHz～13 MHz，支持超聲造影和造影模式下的三維成像。造影劑采用Bracco公司生產(chǎn)的SonoVue(六氟化硫氣體微泡)。

1.4.2 方法 常規(guī)用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉成功后，頸部脫毛，先應(yīng)用二維超聲常規(guī)測量頸總動脈IMT、斑塊面積及動脈血流參數(shù)[血流峰值流速(Vmax)、搏動指數(shù)(PI)、阻力指數(shù)(RI)]。在清晰顯示斑塊二維圖像后局部放大，選擇CPS-SMALL PART 程序進(jìn)入Cadence 造影模式，調(diào)節(jié)圖像至CA 狀態(tài)，探頭輸出功率為-15 dB～-21 dB，機(jī)械指數(shù)為0.18～0.35；由助手經(jīng)兔耳緣靜脈于1 s內(nèi)快速注入超聲造影劑(0.2 mL)。注入造影劑的同時開啟造影程序，使用ACQ軟件對圖像進(jìn)行分析，描記腹主動脈斑塊超聲造影感興趣區(qū)域(ROI)，盡量包繞整個斑塊、避開管腔和斑塊周圍組織，每次ROI盡量在同一水平。通過時間-強(qiáng)度曲線(TIC)分別記錄斑塊造影劑初始到達(dá)時間(AT)、峰值時間(TTP)、持續(xù)時間(△T=TTP-AT)、基礎(chǔ)密度(BI)、峰值強(qiáng)度(PI)、增強(qiáng)密度(EI=PI-BI)、斑塊內(nèi)EI與動脈管腔內(nèi)EI的比值(Ratio)，生成分析數(shù)據(jù)。同步計時和圖像動態(tài)存儲，觀察直至造影劑排空。

所有造影檢查由同一名經(jīng)過培訓(xùn)的超聲醫(yī)師完成，所有的圖像是由經(jīng)驗豐富的兩名超聲醫(yī)生獨(dú)立觀察和分析。

2 結(jié) 果

2.1 頸動脈IMT及MVD密度病理學(xué)檢查結(jié)果 模型組頸動脈IMT均明顯增厚，與正常組、對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，頸總動脈分叉處、頸內(nèi)動脈可見大小不一的斑塊形成。詳見表1。MVD密度病理學(xué)檢查結(jié)果：4周兔頸動脈斑塊中微血管檢出率分別為10%；8周時兔頸動脈斑塊中微血管計數(shù)增加明顯，檢出率為56%。斑塊內(nèi)微血管檢出率：低回聲斑塊(軟斑)混合回聲斑塊>強(qiáng)回聲斑塊(硬斑)。詳見圖1。

表1 各組頸動脈IMT病理檢查結(jié)果(±s) μm

圖A：模型組頸內(nèi)動脈斑塊形成；圖B：超聲造影頸內(nèi)動脈狹窄，斑塊內(nèi)點狀增強(qiáng)信號，主要分布在斑塊的肩部；圖C：頸內(nèi)動脈的斑塊HE染色，內(nèi)膜明顯增厚伴有斑塊形成，斑塊內(nèi)有少量新生血管；圖D：斑塊組織的CD31免疫組化陽性表達(dá)。

圖1 MVD密度病理學(xué)檢查結(jié)果

2.2 超聲檢查結(jié)果

2.2.1 二維超聲檢查結(jié)果 正常組：兔頸動脈內(nèi)膜光滑、纖細(xì)，未見異?；芈?，血流充盈良好。對照組：4周時部分兔子頸動脈中內(nèi)膜較正常組稍增厚，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，部分內(nèi)膜表面稍欠光滑，尚無斑塊形成；8周時內(nèi)膜較正常組明顯增厚(P<0.05)，內(nèi)膜面稍毛糙，回聲稍增強(qiáng)，但仍無斑塊形成。模型組：4周時內(nèi)膜較正常組及對照組均明顯增厚(P<0.05)；29%的動物出現(xiàn)斑塊，斑塊以低回聲和混合回聲為主。實驗8周時，模型組75%的動物出現(xiàn)斑塊，頸內(nèi)動脈中度以上狹窄、閉塞發(fā)生率約25%。斑塊回聲特點：低回聲斑塊15只，混合回聲(強(qiáng)回聲和低回聲混合)14只，強(qiáng)回聲6只。詳見表2、表3。

表2 各組IMT超聲檢查結(jié)果(±s) mm

表3 低回聲和混合回聲斑塊超聲造影增強(qiáng)比較 只

2.2.2 斑塊超聲造影結(jié)果 正常組頸動脈壁上均未見點狀增強(qiáng)影；對照組4周有2只內(nèi)膜增厚的動物內(nèi)膜上見少許點狀增強(qiáng)信號；模型組有2只在斑塊附壁處的動脈管壁內(nèi)出現(xiàn)點狀增強(qiáng)信號；5只低回聲斑塊及2只混合回聲斑塊內(nèi)均有增強(qiáng)信號；8周時，12只斑塊附著處管壁有增強(qiáng)信號，22只低回聲斑塊內(nèi)增強(qiáng)信號明顯。超聲造影參數(shù)結(jié)果顯示：低回聲斑塊EI明顯高于混合回聲斑塊(P<0.05)；而PI、AT、TTP低回聲斑塊與混合回聲斑塊比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。強(qiáng)回聲斑塊內(nèi)部增強(qiáng)信號不明顯。低回聲斑塊及以低回聲為主的斑塊內(nèi)新生血管較豐富，而強(qiáng)回聲斑塊因斑塊回聲強(qiáng)，后方回聲衰減，斑塊內(nèi)增強(qiáng)信號不明顯。詳見表4。

表4 低回聲和混合回聲斑塊超聲造影參數(shù)比較(±s)

2.3 斑塊增強(qiáng)信號參數(shù)與MVD相關(guān)性分析 斑塊內(nèi)超聲造影EI值與MVD呈正相關(guān)。斑塊內(nèi)增強(qiáng)信號分布特點為：低回聲及以低回聲為主的斑塊內(nèi)部增強(qiáng)信號主要集中于斑塊肩部(62.1%)，混合回聲斑塊增強(qiáng)信號多集中于基底部(27.5%)、尾部(10.3%)。詳見表5、表6。

表5 斑塊增強(qiáng)信號部位分布

表6 斑塊增強(qiáng)信號參數(shù)與MVD相關(guān)性分析

3 討 論

兔常用作研究頸動脈斑塊形成的理想動物模型，本研究中超聲檢查和病理檢查都表明采用大耳白兔高脂飲食(膽固醇含量約1.5%)+球囊血管壁損傷方法，4周就能成功建立頸動脈硬化并斑塊形成模型，比Meng 等[5]在8 周內(nèi)形成典型的動脈粥樣硬化明顯提前，而單純高脂飲食的動物雖有動脈硬化表現(xiàn)，但未出現(xiàn)明顯斑塊。因此，動脈內(nèi)膜損傷是頸動脈斑塊形成的關(guān)鍵因素及始動環(huán)節(jié)。原因在于在球囊反復(fù)刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，出現(xiàn)功能障礙，甚至凋謝、剝脫，內(nèi)膜完整性受損，而血液中的脂質(zhì)以脂蛋白的形式從內(nèi)膜受損處沉積于內(nèi)膜下與平滑肌細(xì)胞之間、膠原和彈力纖維上，血液中的高脂狀態(tài)也導(dǎo)致脂質(zhì)的不斷沉積和平滑肌細(xì)胞的持續(xù)增生，從而形成動脈硬化斑塊。

在本研究中，通過超聲造影及病理對照研究表明，斑塊內(nèi)超聲造影EI值與斑塊內(nèi)MVD值明顯相關(guān)，EI值可以作為評價斑塊新生血管程度的一個可靠指標(biāo)。動脈硬化斑塊的血管新生與動脈外膜上滋養(yǎng)血管增多具有一致性。4周時不足17%實驗動物斑塊附著處的外膜上出現(xiàn)點狀增強(qiáng)信號，到造模后8周超過50%的斑塊附著處外膜上出現(xiàn)增強(qiáng)信號，大白兔頸動物外膜滋養(yǎng)血管增生隨著動脈硬化斑塊的發(fā)展而明顯；動脈斑塊內(nèi)部新生血管與外膜上滋養(yǎng)血管同時出現(xiàn)，低回聲斑塊內(nèi)增強(qiáng)信號隨著斑塊的增大，增強(qiáng)信號增多，斑塊內(nèi)的新生血管可能主要由外膜上的滋養(yǎng)血管芽生而來[6]，隨著斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)和斑塊體積增大，斑塊內(nèi)新生血管增多，并向血管內(nèi)皮下生長。但外膜滋養(yǎng)血管增生和斑塊內(nèi)血管新生調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。

在本研究中，斑塊新生血管伴隨斑塊生長而增多，外膜上滋養(yǎng)血管增生與斑塊內(nèi)血管新生具有一致性，斑塊內(nèi)新生血管主要由外膜滋養(yǎng)血管芽生而成。因此，有效抑制斑塊血管的新生或促進(jìn)血管成熟化有可能促進(jìn)斑塊由不穩(wěn)定性向穩(wěn)定性斑塊發(fā)展，從而降低由易損斑塊破潰導(dǎo)致心腦血管意外的發(fā)生概率。