RP—HPLC法同時(shí)測定酶法合成阿莫西林工藝中的原料、中間體和產(chǎn)物的含量

李勝男

摘 要：本文采用高校液相測定了阿莫西林工藝中的原料、中間體和產(chǎn)物中6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林的含量，固定相為：瑞士Hamilton反相液相色譜柱 HxSil C18液相色譜柱（150*4.6mm，5un），乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5）為流動相，檢測波長為230nm；此方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于阿莫西林工藝中的原料、中間體和產(chǎn)物中6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林的含量測定。

關(guān)鍵詞：阿莫西林；原料；含量

酶法合成技術(shù)始于20世紀(jì)60年代末70年代初，現(xiàn)在酶縮合反應(yīng)技術(shù)、產(chǎn)品分離以及固定化酶技術(shù)等方面取得很大的發(fā)展，配套技術(shù)日益完善。酶法產(chǎn)品主要有產(chǎn)品含量穩(wěn)定并且雜質(zhì)低；酶法產(chǎn)品生產(chǎn)批量能夠達(dá)到化學(xué)法產(chǎn)品的2～3倍；有機(jī)溶劑的使用量大幅度減少90%，廢水排放減少80%等特點(diǎn)。本文采用高效液相法對阿莫西林工藝中的原料、中間體和產(chǎn)物中的6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林的進(jìn)行了含量測定。

1 儀器與試藥

LC-2212型液相色譜儀（北京中科惠分儀器有限公司）；蘭博OV3000大容量柱溫箱（天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司）；和泰Master-S超純水機(jī)（自來水為水源）（上海和泰儀器有限公司）；BILON-1000C多用途恒溫超聲提取機(jī)（上海比朗儀器制造有限公司）；600220液相保護(hù)柱（天津琛航科苑科技發(fā)展有限公司）。乙腈（重慶躍翔化工有限公司）、磷酸二氫鉀（重慶躍翔化工有限公司）、三乙胺（重慶躍翔化工有限公司）、磷酸（天津市精強(qiáng)化工有限公司）醋酸乙酯（重慶躍翔化工有限公司）、甲酸（天津市精強(qiáng)化工有限公司）、乙醇（重慶躍翔化工有限公司）、乙酸銨（重慶躍翔化工有限公司）。6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品自制。

2 含量測定

2.1 色譜條件：依據(jù)查閱文獻(xiàn)及考查的結(jié)果，確定色譜條件如下[1-5]。色譜柱為瑞士Hamilton 反相液相色譜柱 HxSil C18液相色譜柱（150*4.6mm，5un）；乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5）為流動相；檢測波長為230nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：30℃。理論板數(shù)按阿莫西林峰計(jì)算應(yīng)不得低于2500。

2.2 供試品溶液的制備

取阿莫西林工藝中的原料、中間體和產(chǎn)物適量，精密稱取，置50mL棕色量瓶中，加流動相適量，超聲處理提取5分鐘，放置至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取105℃干燥5小時(shí)的6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品適量，精密稱取6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品約10mg，置50mL棕色容量瓶中，用加流動相超聲溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL溶液中含6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林0.2mg）。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

制備濃度為50、100、150、200、250、300、350、400μg·mL-1的6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品溶液，分別精密吸取10μL注入HPLC，記錄色譜圖。以峰面積積分值A(chǔ)（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。試驗(yàn)表明，6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品在50～400μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

依照制備對照品溶液，精密吸取6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品溶液10μL重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，對照品峰面積積分值的RSD為0.86%，0.85%，0.86%，0.93%。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別稱取同批樣品6份，分別依照2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)下方法測定含量，并計(jì)算樣品的RSD值為0.75%，0.81%，0.79%，0.85%，結(jié)果表明，此含量測定方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

依照供試品制備方法制備供試品溶液，分別在0，30，60分鐘精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，進(jìn)樣測定，供試品6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林峰面積積分值的RSD為0.77%，0.76%，0.81%，0.85%。結(jié)果表明6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林至少在60分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn)，取已知含量的同一批供試品各6份，精密稱定，分精密添加一定量的6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品，按供試品制備所述方法制備供試品溶液，測定含量（同時(shí)測定樣品含量），計(jì)算回收率。6次測定的平均回收率為99.5%，99.3%，99.5%，99.3%，RSD為0.86%，0.79%，0.81%，0.78%。

3 討論

分別考察乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5），乙腈-30mmol·L-1碳酸氫銨水溶液（含有0.7%氨水、0.1%三乙胺）線性梯度洗脫，乙腈-水（46∶54），乙腈-水-三乙胺（30：70：0.1）；0.2%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)p H至5.3）-乙腈（65∶35）；甲醇-乙腈-甲酸-水（30：10：1：59）；不同比例的流動相，結(jié)果以乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5）為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5）為流動相。

參考文獻(xiàn)

[1]周曉溪，顧立素，逄渙歡，胡昌勤，馮芳.阿莫西林/克拉維酸鉀原料及制劑中有關(guān)物質(zhì)測定方法的比較[J].中國抗生素雜志，2005（12）.

[2]楊澤民，陳吉生，杜志昂，符玲海.反相高效液相色譜法同時(shí)測定阿莫維酸鉀中阿莫西林和克拉維酸鉀的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1999（09）.

[3]張珂.HPLC法測定阿莫西林克拉維酸鉀顆粒的含量[J].藥學(xué)進(jìn)展，2007（05）.

[4]丁一冰，吳永淳，伊芳，王靜，隋國福.HPLC法測定阿莫西林克拉維酸鉀復(fù)方制劑的含量[J].黑龍江醫(yī)藥，1997（02）.

[5]王川平，任進(jìn)民，孫倩，張曉青，徐智儒.RP-HPLC法同時(shí)測定人血清中阿莫西林、克拉維酸鉀濃度[J].中國藥師，2004（03）.