葡聚糖分子量對玉米醇溶蛋白接枝物結(jié)構(gòu)和乳化性的影響

趙城彬，張 浩，鄢健楠，許秀穎，劉美宏，曹 勇，吳玉柱，劉景圣※

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葡聚糖分子量對玉米醇溶蛋白接枝物結(jié)構(gòu)和乳化性的影響

趙城彬1，張 浩1，鄢健楠2，許秀穎1，劉美宏1，曹 勇1，吳玉柱1，劉景圣1※

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 小麥和玉米深加工國家工程實驗室，長春 130118；2. 東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

為了探究葡聚糖接枝作用對玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)和乳化性的影響，明確蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性的關(guān)系，本研究以玉米醇溶蛋白（Zein）和不同分子量（6、20、40和70 kDa）葡聚糖（dextran，DX）為原料，采用濕熱法制備Zein-DX接枝物，并對接枝物的結(jié)構(gòu)和乳化性進行研究。結(jié)果表明，低分子量（6 kDa）DX具有更高的反應(yīng)活性，賴氨酸和精氨酸是參與Zein與DX接枝反應(yīng)的主要氨基酸。傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）證明了DX以共價鍵與Zein形成了復(fù)合物。DX的共價接枝能夠?qū)е耑ein熒光猝滅的發(fā)生，降低Zein的熱穩(wěn)定性，改善Zein的乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）。低分子量（6 kDa）DX與Zein形成的接枝物最大發(fā)射波長發(fā)生顯著紅移，三級結(jié)構(gòu)變的松散，具有更低的熱穩(wěn)定性，且EAI最高達到（23.28±0.71）m2/g。然而，高分子量（70 kDa）DX與Zein形成的接枝物ESI高達（26.44±0.47）min，高于其他Zein-DX接枝物樣品。乳狀液粒徑和流變性分析表明，隨著DX分子量的增加，乳狀液粒徑降低，黏度增加，這與ESI的研究結(jié)果相符。研究結(jié)果可為改善玉米蛋白功能性和深入了解玉米蛋白改性機制提供理論依據(jù)。

玉米醇溶蛋白；黏度；乳化；葡聚糖；接枝物；結(jié)構(gòu)

0 引 言

玉米醇溶蛋白（Zein）是玉米加工副產(chǎn)物玉米黃粉中主要蛋白質(zhì)成分，一般采用溶劑法提取，屬于醇溶性谷蛋白。Zein被美國食品藥品監(jiān)督管理局被認為是安全且有價值的食品原料，具有無毒、可降解、環(huán)保、可食用等優(yōu)點[1]。Zein分子中非極性氨基酸殘基占氨基酸總量的一半以上，由于具有較強疏水性使其不溶于水而溶于乙醇溶液。此外，在pH值大于11的堿性溶液中溶解性較大，有機溶劑和強堿的使用限制了Zein在食品加工中的應(yīng)用[2]。

近年來，蛋白質(zhì)接枝改性作為一種綠色、安全、無污染的改性方法而受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。由于該反應(yīng)不需要催化劑，并在可控的條件下獲得所需的反應(yīng)產(chǎn)物，可以作為新功能性材料應(yīng)用于食品工業(yè)、生物材料及醫(yī)藥科學等領(lǐng)域[3]。蛋白質(zhì)的接枝改性發(fā)生在糖分子的還原羰基與蛋白質(zhì)的ε-氨基之間，在美拉德反應(yīng)基礎(chǔ)上，通過縮合、重排形成糖基胺重排產(chǎn)物即蛋白質(zhì)-糖接枝物，能夠顯著改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，這與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾密切相關(guān)[4]。Li等[5]研究接枝反應(yīng)對花生蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)花生蛋白-多糖接枝物具有較高的溶解性和乳化性，同時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變的更加松散，這可能是改善蛋白質(zhì)功能性的重要因素。Zhang等[6]對大豆蛋白-葡聚糖接枝物穩(wěn)定的水包油乳液的凍融穩(wěn)定性進行研究，發(fā)現(xiàn)油滴尺寸以及絮凝和聚結(jié)程度均降低，乳狀液穩(wěn)定性得到明顯改善。Fan等[7]采用乳清蛋白-葡聚糖接枝物制備納米乳液，并對其理化穩(wěn)定性和體外消化性進行分析，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白與葡聚糖接枝反應(yīng)能夠降低納米乳液的粒徑，增加其穩(wěn)定性，尤其是蛋白質(zhì)等電點附近的穩(wěn)定性，同時改善體外消化性。胥偉等[8]研究發(fā)現(xiàn)蛋清粉與葡聚糖共價接枝能夠顯著改善蛋清粉的凝膠性、乳化性、起泡性和熱穩(wěn)定性。然而，關(guān)于Zein與葡聚糖（dextran，DX）的接枝反應(yīng)以及接枝物結(jié)構(gòu)和乳化性的研究鮮有報道。本試驗將Zein與不同分子量DX發(fā)生接枝反應(yīng)制備Zein-DX接枝物，采用傅里葉紅外光譜、熒光光譜和DSC分析接枝物的分子結(jié)構(gòu)和熱特性，同時對接枝物的乳化性進行研究，探究不同分子量DX對Zein接枝物分子結(jié)構(gòu)和乳化性的影響，為改善玉米蛋白功能性和深入了解玉米蛋白改性機制以及促進玉米精深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

試驗材料：玉米醇溶蛋白（Zein），百靈威科技有限公司，采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為（91.36±0.82）%；分子量為6、20、40、70 kDa的葡聚糖（DX），美國Sigma公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），美國Sigma公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），南京化學試劑股份有限公司；溴化鉀，上海化學試劑公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純級。

主要儀器：Alpha1-4LDplus冷凍干燥機，德國Christ公司；1600PC紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；CM-5分光色差儀，日本柯尼卡美能達公司；L-8900A全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；VERTEX 70傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker公司；F-4500熒光分光光度計，日本Hitachi公司；差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC），美國TA公司；Spectra Max 190酶標儀，美谷分子儀器有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；流變儀，奧地利Anton Paar公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Zein-DX接枝物制備

將玉米醇溶蛋白（Zein）分散到KCl-NaOH緩沖液（0.2 mol/L，pH值12.0）中，常溫下磁力攪拌1 h使蛋白質(zhì)充分溶解，配成質(zhì)量分數(shù)為1%的Zein溶液。以蛋白多糖質(zhì)量比為2:1的比例添加6、20、40和70 kDa的葡聚糖（DX），磁力攪拌均勻得到混合溶液，然后在85℃水浴中熱處理2 h，冰浴冷卻至室溫，離心分離取上清液，調(diào)節(jié)pH為7.0，4℃透析24 h，冷凍干燥即得Zein-DX接枝物，分別用Zein-DX6、Zein-DX20、Zein-DX40、Zein-DX70表示。不含DX的天然Zein為對照組。

1.2.2 游離氨基含量和接枝度測定

將80 mg的OPA溶解在2 mL體積分數(shù)為95%的乙醇中，并與50 mL 10 mmol/L的四硼酸鈉緩沖液（pH值9.7）、5 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的SDS以及200L的β-巰基乙醇混合，充分混勻后用蒸餾水稀釋至100 mL配成OPA試劑。將200L的蛋白樣品溶液（2 mg/mL）與4 mL的OPA試劑在室溫下反應(yīng)5 min，然后采用紫外可見分光光度計測定340 nm下的吸光度，相同操作下蒸餾水代替反應(yīng)液作為空白，以賴氨酸為標準物作標準曲線計算樣品中游離氨基含量。接枝度（degree of graft，DG）的計算公式如式（1）。

式中0為未反應(yīng)（0 min）的蛋白質(zhì)吸光度；A為接枝物的吸光度。

1.2.3 色澤測定

采用色差儀對樣品色澤進行測定，具體操作參照Liu[9]的方法。以國際照明委員會（CIE）建立的顏色參數(shù)（*值、*值、*值）為標準，*值表示紅（+）到綠（-），*值表示黃（+）到藍（-），*值表示黑（0）到白（100）。

1.2.4 氨基酸含量測定

采用全自動氨基酸分析儀測定氨基酸組成。測定前將樣品進行預(yù)處理，具體操作參考Li等[10]的方法。取 20 mg樣品放入到試管中，然后加入10 mL 6 mol/L的HCl溶液，再添加100L的β-巰基乙醇?；靹蚝筮M行液氮冷凍，然后用氮氣密封。在110 ℃下水解22 h，然后添加2 mL pH值為2.2的三氯乙酸（TCA），4 ℃下反應(yīng)2 h，然后將反應(yīng)液通過0.22 nm的過濾膜過濾。

1.2.5 傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared, FTIR）測定

參照Zhao等[11]的方法測定FTIR，將蛋白樣品與溴化鉀研磨成均勻粉末，壓片后置于紅外光譜儀中進行測定。紅外光譜儀的測定溫度為25 ℃，波數(shù)掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，波數(shù)精度為0.01 cm-1，掃描次數(shù)為64次。

1.2.6 內(nèi)源熒光光譜測定

參考Sun等[12]的方法，采用F-4500熒光分光光度計測定蛋白樣品的內(nèi)源熒光光譜。樣品濃度為0.2 mg/mL，設(shè)定激發(fā)波長和發(fā)射波長的夾縫寬均為5 nm，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長掃描范圍為290～450 nm，掃描速度為100 nm/min。

1.2.7 熱性質(zhì)（differential scanning calorimetry, DSC）測定

根據(jù)Zhao等[13]的方法，凍干蛋白樣品的熱性質(zhì)分析采用DSC熱分析儀進行測定。將3 mg樣品放入鋁盤中，蓋上蓋子壓片，放入DSC儀器中測定。以10 ℃/min升溫速率將樣品由30 ℃加熱到160 ℃，氮氣速率為40 mL/min，空鋁盤作為對照。采用熱力學分析軟件STARe 6.1對熱分析圖進行分析，得到起始溫度（T）、峰值溫度（T）、終止溫度（T）和熱焓變（D）等熱力學參數(shù)。

1.2.8 乳狀液制備

將蛋白樣品溶于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值7.5）中，配成蛋白濃度為5 mg/mL的溶液，添加質(zhì)量分數(shù)為0.02%的NaN3抑制微生物生長，室溫下磁力攪拌 2 h，4℃過夜使蛋白充分水合。取15 mL的蛋白溶液與 5 mL的玉米胚芽油混合，采用高速均質(zhì)機在12 000 r/min下高速均質(zhì)乳化1 min即得乳狀液。

1.2.9 乳化性測定

蛋白樣品的乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）根據(jù)Molina等[14]的濁度法進行測定。將制備好的乳狀液分別在0和30 min時，從測試管底部取50L樣品，用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS溶液稀釋100倍，采用Spectra Max 190酶標儀在500 nm處測定樣品的吸光度，以SDS溶液為空白。EAI和ESI的計算公式如式（2）～（3）。

式中0和30分別為0和30 min時的吸光度；DF為稀釋倍數(shù)（100）；為蛋白質(zhì)濃度，g/mL；為乳狀液中油相所占比例（0.25）。

1.2.10 乳狀液粒徑測定

參考Zhao等[15]的測定方法，采用Mastersizer 2000激光粒度儀在室溫下測定乳狀液的粒徑分布。測定轉(zhuǎn)速為1 900 r/min，折射率指數(shù)為1.46，吸收率為0.01，乳狀液的平均粒徑采用體積平均直徑（43）來表示。

1.2.11 乳狀液流變性測定

根據(jù)Liang等[16]的測定方法，采用流變儀測定乳狀液的流變學特性。溫度設(shè)置為25 ℃，探頭選擇直徑為 25 mm的PP25平板，平板與測試板間距為1 mm，剪切速率掃描范圍為0～100 s-1。取一定量乳狀液樣品于測試板上，擦去多余的樣品液，套上保溫套，測定乳狀液的黏度隨剪切速率的變化。

1.3 統(tǒng)計分析

每組試驗重復(fù)3次，采用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析，作圖采用Origin8.5軟件完成，<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zein-DX接枝物接枝度和色澤分析

表1為Zein-DX接枝物的游離氨基含量、接枝度和色澤。由表1可以看出，與天然Zein相比，Zein-DX接枝物的游離氨基含量顯著降低（<0.05）。Hiller等[17]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的游離ε-氨基和多糖的還原羰基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，這是導(dǎo)致游離氨基含量降低的主要原因，這也說明蛋白質(zhì)和多糖之間發(fā)生了共價接枝反應(yīng)。隨著DX分子量的減小，游離氨基含量逐漸降低，接枝度逐漸升高，這表明低分子量（6 kDa）DX更容易與Zein發(fā)生接枝反應(yīng)，這可能由于低分子量多糖具有較弱的空間 位阻作用，利于反應(yīng)基團的相互接觸，進而促進反應(yīng) 進行[18]。

表1 Zein-DX接枝物的游離氨基含量、接枝度和色澤

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著（<0.05）；Zein代表不含DX的天然蛋白；Zein-DX6、Zein-DX20、Zein-DX40和Zein-DX70分別代表Zein與6、20、40和70 kDa DX形成的接枝物，下同。

Note: Different lower case letters in the same column indicate significant difference (<0.05);Zein represents the native protein that does not contain DX; Zein-DX6, Zein-DX20, Zein-DX40 and Zein-DX70 represents the conjugates that prepared by Zein and DX with 6, 20, 40 and 70 kDa, respectively, the same below.

在美拉德反應(yīng)高級階段，蛋白質(zhì)和多糖能夠形成褐色復(fù)合物，可通過色差儀測定產(chǎn)物色澤變化。由*、*、*的變化可以看出，與對照組Zein相比，Zein-DX接枝物*和*顯著增加（<0.05），而*顯著降低（<0.05），這表明Zein與DX之間發(fā)生了接枝反應(yīng)，產(chǎn)生了褐色產(chǎn)物。隨著DX分子量的降低，接枝物的褐變程度加劇，說明低分子量（6 kDa）多糖的反應(yīng)活性更高，這與接枝度的分析結(jié)果一致。這可能是由于低分子量（6 kDa）DX能夠暴露出更多活性羰基，使活性中間產(chǎn)物含量增加，并與其他活性前體連接、聚合，在美拉德反應(yīng)最終階段形成褐色聚合物[19]。

2.2 Zein-DX接枝物氨基酸分析

接枝反應(yīng)發(fā)生在糖的還原羰基和蛋白質(zhì)的ε-氨基之間，可以通過氨基酸的減少來判斷，主要是賴氨酸和精氨酸[20]。圖1為Zein-DX接枝物的賴氨酸和精氨酸含量，由圖1可知，Zein-DX接枝物的賴氨酸和精氨酸含量均低于對照組Zein，這表明蛋白質(zhì)中的賴氨酸和精氨酸很可能是參與接枝反應(yīng)的游離氨基。此外，隨著DX分子量的減少，接枝物的游離氨基含量進一步降低，說明低分子量（6 kDa）DX與Zein的接枝反應(yīng)水平較高，這與接枝度和色澤的分析結(jié)果一致。Li等[21]對大米蛋白接枝物氨基酸含量進行研究，發(fā)現(xiàn)高分子量多糖與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物賴氨酸含量較高，說明接枝反應(yīng)速率較慢。Kato[22]的研究結(jié)果也表明由于空間位阻作用，高分子量DX具有較低的反應(yīng)活性，導(dǎo)致接枝物具有較高的賴氨酸和精氨酸含量?？梢钥闯?，本文得到的結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似。

圖1 Zein-DX接枝物的賴氨酸和精氨酸質(zhì)量分數(shù)

2.3 Zein-DX接枝物紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜技術(shù)（FTIR）是通過分子振動引起輻射吸收，從而提供大分子的官能團和化學鍵信息，可用于蛋白質(zhì)-糖共價接枝物的定性分析。圖2為Zein-DX接枝物傅里葉紅外光譜（FTIR），由圖2可知，與對照組Zein相比，Zein-DX接枝物分別在3 200～3 700 cm-1和1 000～1 260 cm-1波長范圍內(nèi)出現(xiàn)強吸收峰，這是由C-O-C糖苷鍵的伸縮振動和游離-OH的伸縮振動產(chǎn)生 的[23]，表明多糖以共價鍵與蛋白質(zhì)形成了復(fù)合物。Zein- DX接枝物在酰胺Ⅰ（1 689 cm-1）和酰胺Ⅲ（1 409 cm-1）處的吸收峰增強，這可能是接枝反應(yīng)過程中產(chǎn)生的希夫堿等中間產(chǎn)物引起吸收峰的變化，在大豆分離蛋白與羧甲基纖維素接枝反應(yīng)的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象[24]。此外，Zein-DX接枝物在860和545 cm-1處均出現(xiàn)強吸收峰，進一步說明DX的共價接枝使Zein的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖2 Zein-DX接枝物傅里葉紅外光譜（FTIR）

2.4 Zein-DX接枝物內(nèi)源熒光光譜分析

內(nèi)源熒光光譜被認為是能夠提供蛋白質(zhì)周圍微環(huán)境結(jié)構(gòu)信息的一種有效技術(shù)有段，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的信息能夠通過熒光光譜獲得。圖3為Zein-DX接枝物的內(nèi)源熒光光譜，由圖3可知，天然Zein的最大發(fā)射波長（max）在304 nm附近，這主要是由于酪氨酸殘基引起的。Sun等[25]對玉米醇溶蛋白（Zein）的研究發(fā)現(xiàn)，Zein分子中酪氨酸殘基含量相對較高，在304 nm波長處具有最大吸收峰。與天然Zein相比，Zein-DX接枝物具有更低的熒光強度，表明Zein與DX共價接枝能夠?qū)е聼晒忖绲陌l(fā)生，Sun等[26]在卵清蛋白的接枝反應(yīng)研究中也得到了相似的結(jié)果。熒光猝滅可能歸因于多種分子間相互作用，包括分子重排、能量轉(zhuǎn)移、復(fù)合物的形成和碰撞猝滅 等[27]。本文中熒光猝滅的發(fā)生可能是由于DX與Zein的酪氨酸基團發(fā)生作用形成共價復(fù)合物，從而減少酪氨酸殘基在溶劑中暴露導(dǎo)致的。此外，多糖鏈的屏蔽作用也能夠引起Zein熒光強度的降低[28]。隨著DX分子量的減小，Zein-DX接枝物的熒光強度逐漸降低，表明低分子量 （6 kDa）DX與Zein形成的接枝物熒光猝滅現(xiàn)象更顯著，這可能與較高的接枝度有關(guān)（表1）。

Zein與6、20、40和70 kDa的DX形成的接枝物max分別為312.4、310.6、308.3和307.6 nm，相比于天然Zein的max（304 nm）發(fā)生了不同程度的紅移，說明DX的共價接枝能夠改變Zein的空間構(gòu)象，使Zein的三級結(jié)構(gòu)變的松散。隨著DX分子量減小，接枝物的max紅移程度增大，低分子量（6 kDa）DX與Zein形成的接枝物具有更松散的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)合接枝度分析（表1）可以看出，較高接枝度的Zein-DX接枝物具有更松散的三級結(jié)構(gòu)。Spotti等[29]在乳清蛋白-葡聚糖接枝物的熒光光譜分析中發(fā)現(xiàn)，共價接枝后max發(fā)生紅移，且隨著多糖分子量的降低，接枝度增加，max紅移程度更大，這與本文的研究結(jié)果一致。

圖3 Zein-DX接枝物的內(nèi)源熒光光譜

2.5 Zein-DX接枝物DSC分析

差示掃描量熱法（DSC）可以直接測量蛋白質(zhì)在溫度升高或降低過程中所引起的熱量變化，主要包括熱變性峰值溫度（T）和熱變性引起的熱焓變（D），可用于反映蛋白質(zhì)空間構(gòu)象及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[30]。圖4為Zein-DX接枝物的DSC熱分析圖，由圖4可知，與天然Zein相比，Zein-DX接枝物具有更高的反應(yīng)吸收熱，而且吸熱峰均向左偏移，即吸熱峰溫度更低。

圖4 Zein-DX接枝物的DSC熱分析圖

表2為Zein-DX接枝物的DSC熱力學參數(shù)，與天然Zein相比，Zein-DX接枝物具有較小的T值和T值，根據(jù)Baeza等[31]的報道，T值和T值減小表明熱穩(wěn)定性的降低，這說明DX的共價接枝會降低Zein的熱穩(wěn)定性。接枝反應(yīng)使Zein分子解折疊，結(jié)構(gòu)變的更加松散，同時引入的多糖分子具有較大的空間位阻作用，阻止了蛋白質(zhì)聚集，這可能是導(dǎo)致熱穩(wěn)定性降低的主要原因[32]。隨著DX分子量的減小，Zein-DX接枝物的T由89.72 ℃降低至83.39℃，表明低分子量（6 kDa）DX與Zein形成的接枝物具有更低的熱穩(wěn)定性，這可能與較高的接枝反應(yīng)程度有關(guān)（表1）。DX共價接枝會使Zein的D顯著降低（<0.05），隨著DX分子量的減小，Zein-DX接枝物的D進一步降低，這可能與Zein的解折疊狀態(tài)有關(guān)[33]。此外，Zein與DX發(fā)生接枝反應(yīng)可能會使蛋白質(zhì)失去部分二級結(jié)構(gòu)，如α-螺旋含量會降低，這可能也會對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。由此可知，接枝度越高，Zein-DX接枝物的T和D越低，其熱穩(wěn)定性越低。

表2 Zein-DX接枝物的DSC熱力學參數(shù)

2.6 Zein-DX接枝物乳化性分析

蛋白質(zhì)的乳化能力為緊密吸附在油-水界面的能力，油-水界面中的表面活性蛋白能夠降低界面張力，阻止液滴聚集和相分離的發(fā)生，從而形成穩(wěn)定的油-水界面膜。表3為Zein-DX接枝物的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI），由表3可知，天然Zein的EAI和ESI分別為（11.57±0.54）m2/g和（12.23±0.68）min。與天然Zein相比，Zein-DX接枝物的EAI和ESI均顯著提高（<0.05），這可能是由于多糖中親水基團的引入提高了蛋白質(zhì)的親水性，接枝反應(yīng)使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變的松散，能夠暴露出蛋白分子內(nèi)部的疏水基團，增加了其疏水性，蛋白質(zhì)的親水/疏水平衡得到改善，有效降低界面張力，從而提高了蛋白質(zhì)的乳化性[34]。隨著DX分子量的減小，Zein-DX接枝物的EAI由（16.64±0.65）m2/g增加至（23.28± 0.71）m2/g，表明低分子量（6 kDa）DX與Zein形成的接枝物具有更高的乳化活性，這可能是由于Zein-DX6具有更高的接枝度（表1），導(dǎo)致油-水吸附性增強。這說明Zein-DX接枝物的EAI隨著接枝度的增加而升高。隨著DX分子量的增大，Zein-DX接枝物的ESI由（19.95± 0.58）min增加至（26.44±0.47）min，這可能與高分子量多糖具有較大的空間位阻作用有關(guān)。Pugnaloni等[35]研究表明，蛋白質(zhì)-多糖接枝物能夠在液滴附近形成混合的多分子層結(jié)構(gòu)，從而降低液滴的聚集程度，達到改善乳化性的目的。

表3 Zein-DX接枝物的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）

2.7 Zein-DX接枝物乳狀液粒徑分析

圖5為Zein-DX接枝物乳狀液的粒徑分布（圖5a）及平均粒徑（圖5b）。由圖5a可知，Zein-DX接枝物乳狀液的粒徑分布與Zein乳狀液相似，均呈單峰分布，表明DX的共價接枝不會改變Zein乳狀液粒徑分布的峰型。然而，Zein-DX接枝物乳狀液的粒徑分布范圍變寬，且更多的分布在小粒徑范圍。由圖5b可知，Zein-DX接枝物乳狀液的平均粒徑顯著低于Zein乳狀液。一般來說，乳狀液的平均粒徑越小，乳狀液的穩(wěn)定性越高[36]，說明DX的共價接枝能夠提高Zein乳狀液的穩(wěn)定性。這主要是由于Zein-DX接枝物能夠吸附在油-水界面上形成較厚的空間界面膜，提高蛋白質(zhì)乳化能力，且在液滴間產(chǎn)生排斥作用，抑制液滴聚集，從而提高乳狀液穩(wěn)定性[37]。Yin等[38]采用美拉德反應(yīng)將玉米蛋白肽分別與葡聚糖（16 kDa）和麥芽糊精（3 kDa）制備成共價接枝物，并對接枝物的乳化性進行研究，發(fā)現(xiàn)玉米蛋白肽與多糖形成的共價接枝物使乳狀液的平均粒徑顯著降低，有效改善了乳狀液的穩(wěn)定性，這與本文的研究結(jié)果相似。此外，隨著DX分子量的增大，接枝物乳狀液的平均粒徑進一步降低，說明高分子量DX（70 kDa）與Zein形成的接枝物具有最好的乳化穩(wěn)定性。這可能是由于高分子量DX的空間位阻效應(yīng)會對乳狀液中液滴的聚集起到抑制作用，阻止大液滴的形成，促進小液滴的分散，導(dǎo)致較低的平均粒徑。

圖5 Zein-DX接枝物乳狀液的粒度特征

2.8 Zein-DX接枝物乳狀液流變性分析

流變性是評價乳狀液穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)，食品中大多數(shù)乳狀液都顯示出剪切變稀行為，這對乳液在流動過程中黏度的控制尤為重要[39]。圖6為Zein-DX接枝物乳狀液黏度隨剪切速率的變化，由圖6可知，所有乳狀液樣品的黏度都隨著剪切速率的增加而降低，最終達到平衡，此為典型的假塑性流體特性。與天然Zein相比，Zein-DX接枝物乳狀液的黏度均增加，且隨著DX分子量的增大，乳狀液黏度進一步增加。Liu等[40]對核桃乳狀液的研究發(fā)現(xiàn)，高黏度乳狀液能夠阻礙液滴的相互聚集，從而提高乳狀液的物理穩(wěn)定性。高分子量（70 kDa）DX由于具有較大的空間位阻排斥作用，與Zein形成的接枝物乳狀液黏度最大，表明Zein-DX70形成的乳狀液穩(wěn)定性最好，這與本文中乳狀液粒徑分析結(jié)果一致。通過乳狀液粒徑分析（圖5）和流變性分析（圖6）可以看出，乳狀液穩(wěn)定性與接枝度關(guān)系不大，而高分子量（70 kDa）DX的空間位阻效應(yīng)是改善Zein-DX接枝物乳狀液穩(wěn)定性的主要因素。

圖6 Zein-DX接枝物乳狀液黏度隨剪切速率的變化

3 結(jié) 論

將玉米醇溶蛋白（Zein）與不同分子量葡聚糖（DX）發(fā)生接枝反應(yīng)，隨著DX分子量的減小，Zein-DX接枝物的游離氨基含量降低，接枝度升高，顏色加深，說明低分子量DX具有更高的反應(yīng)活性。賴氨酸和精氨酸是參與接枝反應(yīng)的主要氨基酸。傅里葉紅外光譜分析證明了Zein與不同分子量DX均形成了共價復(fù)合物。熒光光譜分析表明，Zein與DX共價接枝能夠?qū)е聼晒忖绲陌l(fā)生，低分子量DX與Zein形成的接枝物熒光猝滅現(xiàn)象更顯著，且最大發(fā)射波長的紅移程度更大，說明較高接枝度的Zein-DX接枝物具有更松散的三級結(jié)構(gòu)。DSC分析表明，DX的共價接枝會降低Zein的熱穩(wěn)定性，且接枝度越高，Zein-DX接枝物的熱變性峰值溫度和熱焓變越低，其熱穩(wěn)定性越低。乳化性分析表明，接枝反應(yīng)能夠提高Zein的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI），這可能與松散的三級結(jié)構(gòu)和較低的熱穩(wěn)定性有關(guān)。低分子量DX與Zein形成的接枝物具有更高的EAI為（23.28± 0.71）m2/g，這可能是由于Zein-DX6具有較高接枝度導(dǎo)致的，說明Zein-DX接枝物的EAI隨著接枝度的增加而升高。而高分子量DX與Zein形成的接枝物具有更高的ESI為（26.44±0.47）min，這可以在乳狀液粒徑和流變性分析中證明。高分子量DX與Zein形成的接枝物乳狀液具有更小的平均粒徑和更大的黏度，從而導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性提高。這是由于高分子量DX的空間位阻效應(yīng)會對乳狀液中液滴的聚集起到抑制作用，同時增加乳狀液黏度，利于Zein-DX接枝物乳狀液的穩(wěn)定。

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Effect of dextran molecular weight on structure and emulsifying property of zein conjugates

Zhao Chengbin1, Zhang Hao1, Yan Jiannan2, Xu Xiuying1, Liu Meihong1, Cao Yong1, Wu Yuzhu1, Liu Jingsheng1※

(1.130118,; 2.150030,)

In order to investigate the effect of conjugation by dextran on the structure and emulsifying property of zein and the relationship between protein structure and functional properties, zein-dextran conjugates were prepared by conjugating zein and dextran with different molecular weights (6, 20, 40 and 70 kDa) under wet-heated Maillard reaction at 85 ℃ for 2 h. The free amino content, degree of graft, colour and amino acid content for zein-dextran conjugates were measured by UV-vis (ultra-violet-visible) spectrophotometer, colorimeter and automatic amino acid analyzer. For the zein-dextran conjugates, the free amino content was reduced, and a* and b* increased, while L* decreased in comparison with native zein, indicating the covalent graft reaction between protein and polysaccharide. As the decrease of the molecular weight of dextran, the conjugate prepared by zein and dextran with low molecular weight (6 kDa) had lower free amino content, higher degree of graft and darker colour, which suggested that the dextran with low molecular weight (6 kDa) was more reactive. The amino acid analysis indicated that lysine and arginine were the main amino acids involved in conjugation reaction between zein and dextran. The structures of conjugates were researched using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), intrinsic fluorescence spectroscopy and differential scanning calorimetry (DSC). FTIR demonstrated that zein and dextran with different molecular weights could form the covalent conjugates. The covalent conjugation of dextran could result in the fluorescence quenching of zein and reduce the thermal stability of zein. The bathochromic shift of fluorescence emission maximum wavelength for the conjugate prepared by zein and dextran with low molecular weight (6 kDa) occurred, leading to looser tertiary structure. Moreover, zein conjugating with the dextran with 6 kDa molecular weight had lower thermal stability, revealing that zein-dextran conjugate with higher degree of graft had a looser tertiary structure, and the higher the degree of graft, the lower the thermal denaturation peak temperature and enthalpy, the lower the thermal stability of zein-dextran conjugates, which might be an important reason for improving the emulsifying activity index (EAI) and emulsifying stability index (ESI) of zein-dextran conjugates. The emulsifying properties of conjugates were researched using microplate reader, laser particle sizer and dynamic rheometer. The EAI and ESI of native zein were (11.57±0.54) m2/g and (12.23±0.68) min, respectively. The EAI and ESI of zein-dextran conjugates were higher than that of native zein, indicating the significant improvement of emulsifying properties of zein by the covalent conjugation of dextran. The conjugate prepared by zein and dextran with low molecular weight (6 kDa) had higher EAI of (23.28±0.71) m2/g, which could be related to higher degree of graft, suggesting that the EAI of zein-dextran conjugates improved with the increase of degree of graft. However, the conjugate prepared by zein and dextran with high molecular weight (70 kDa) had higher ESI of (26.44±0.47) min. It was possible that the dextran with high molecular weight (70 kDa) had a large steric hindrance, inhibiting the aggregation of droplets in emulsion and forming more droplets with smaller size. Meanwhile, the emulsion was more viscous, which also resulted in the improvement of emulsion stability. These could be confirmed by particle size and rheological analysis of emulsion. It could be seen that the emulsion stability had little relation to degree of graft. However, the steric hindrance effect of dextran with high molecular weight (70 kDa) was the main factor to improve the stability of zein-dextran conjugate emulsions. The results of this study can provide theoretical basis for improving the functional properties of corn protein and understanding its modification mechanism.

zein; viscosity; emulsification; dextran; conjugates; structure

趙城彬，張 浩，鄢健楠，許秀穎，劉美宏，曹 勇，吳玉柱，劉景圣.葡聚糖分子量對玉米醇溶蛋白接枝物結(jié)構(gòu)和乳化性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2018，34(14)：288－295.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.14.037 http://www.tcsae.org

Zhao Chengbin, Zhang Hao, Yan Jiannan, Xu Xiuying, Liu Meihong, Cao Yong, Wu Yuzhu, Liu Jingsheng. Effect of dextran molecular weight on structure and emulsifying property of zein conjugates[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(14): 288－295. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.14.037 http://www.tcsae.org

2018-01-02

2018-04-12

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0400702）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-02-30）；吉林省教育廳科學研究項目（JJKH20180654KJ）；吉林農(nóng)業(yè)大學科研啟動基金資助項目（201715）

趙城彬，講師，博士，主要從事糧食、油脂及植物蛋白工程研究工作。Email：zhaochengbin66@126.com

劉景圣，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事糧食深加工與功能性食品研究工作。Email：liujingshengname@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.14.037

TS201.2

A

1002-6819(2018)-14-0288-08