棘胸蛙的性腺分化及溫度對其性別決定的影響

梅祎蕓，鄭榮泉,3,*，鄭善堅，嚴 紅，劉志芳，張啟鵬，王志剛，洪 燕

1 浙江師范大學(xué)野生動物保護與利用技術(shù)中心，金華 321004 2 浙江省野生動物生物技術(shù)與保護利用重點實驗室，金華 321004 3 浙江師范大學(xué)行知學(xué)院，金華 321004

動物的性別決定和分化一直是生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。目前已知，脊椎動物的性別決定機制主要有遺傳性決定(Genetic sex determination，GSD)和環(huán)境性決定(Environmental sex determination，ESD)兩大類。高等脊椎動物的性別分化主要受細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)影響，而低等脊椎動物異型性染色體的缺乏或者分化滯后致使其性別分化主要受性分化敏感期的環(huán)境影響[1- 5]，其中溫度是主要的環(huán)境因素，因而又可稱為溫度依賴型性別決定(Temperature-dependent sex determination，TSD)。在TSD中，溫度敏感期(thermosensitive period, TSP)是溫度對性別比例起決定作用的時期[6]，期間溫度的高低會影響胚胎的性別。

有關(guān)溫度影響兩棲動物性別分化的研究表明，在高溫下，無尾目及有尾目會出現(xiàn)雄化現(xiàn)象，如李新紅等[4]發(fā)現(xiàn)于30℃培育的中國林蛙(Ranachensinensis)雄性比例顯著高于20℃培育的中國林蛙。高溫誘導(dǎo)雄化的現(xiàn)象同樣存在肋突螈屬Pleurodeles、小鯢屬Hynobius、蟾蜍屬Bufo和蛙屬Rana[7- 10]中。然而，一些近緣物種似乎對溫度有不同的反應(yīng)，如與歐非肋突螈P.waltl中的情形相反，具有ZZ/ZW性別決定型的北非肋突螈P.poireti其ZZ基因型的雄性幼體經(jīng)高溫培育后，雌性表型個體(ZZ neo-females)比例升高[11]。研究者在對滯育小鯢(Hynobiusretardatus)的研究中發(fā)現(xiàn)高溫(28℃)可促使其性腺雌性化[12]。因此，兩棲動物溫度影響下的性腺分化的趨勢并不是絕對的，存在著物種間的差異。此外，在有尾兩棲類的近緣物種中這種溫度誘導(dǎo)性別逆轉(zhuǎn)的效果也不完全相同[8]。當前全球氣候變暖、水污染等環(huán)境問題越來越突出，而兩棲動物生長發(fā)育和性別分化等方面易受環(huán)境因素的影響，這就使得其種群性比結(jié)構(gòu)難以預(yù)測，給兩棲動物的保護帶來了極大的挑戰(zhàn)，因此研究環(huán)境因素對兩棲動物性別發(fā)育的影響及其機制顯得尤為迫切。但時至今日，相對于其他的脊椎動物，對兩棲動物性別發(fā)育的了解仍舊較少[13]。

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)是我國特有的大型經(jīng)濟蛙類，其肉質(zhì)細膩且營養(yǎng)豐富，被譽為“百蛙之王”。20世紀80年代以后，我國多地嘗試馴養(yǎng)棘胸蛙，目前為止，產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，并且呈現(xiàn)快速發(fā)展的趨勢[14]。由于雄性棘胸蛙個體大[15]，生長速度快，胸部具有棘刺而易于識別等特點，單性養(yǎng)殖在棘胸蛙養(yǎng)殖中意義顯著，因此探討棘胸蛙性別決定機制具有理論和實踐價值。本試驗將性別尚未分化的棘胸蛙蝌蚪置于不同溫度條件下培育，通過組織學(xué)方法觀察性腺變化，并探討在不同的培育溫度條件下性腺分化的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

棘胸蛙來自浙江金華綠谷清泉生態(tài)石蛙養(yǎng)殖場和建德市鑫泉金石蛙生態(tài)養(yǎng)殖場。2014—2015兩年在棘胸蛙的繁殖季節(jié)(4—9月)，將成蛙池中來自不同親本且同一天產(chǎn)出的受精卵混合，置于孵化箱中流水自然孵化，密度為1000卵粒/m3水體，培養(yǎng)溫度控制自然水溫((23±1)℃)，觀察胚胎發(fā)育，蝌蚪孵出后帶回實驗室中進行實驗。棘胸蛙蝌蚪發(fā)育各期參見Gosner[16]。

1.2 飼養(yǎng)管理

蝌蚪培養(yǎng)時用高蛋白的動物性餌料喂養(yǎng)，每天定時定點投喂一次，投喂餌料量按照蝌蚪體重3%—5%，同時每隔5 d投喂一次蒸熟的苦麻菜(Ixerischinensis(Thunb) Nakai)，以增強蝌蚪的抵抗力；每天在喂食之前換1次培養(yǎng)用水，用吸水泵清除水槽底部的糞便和剩余飼料，每次吸出1/2培養(yǎng)用水，再補充等經(jīng)過充分曝氣的制冷或加溫的自來水；蝌蚪培養(yǎng)時每組水體中放入增氧泵不間斷增氧，并用凈水器形成循環(huán)流水，在養(yǎng)殖箱中放置1—2片瓦片遮陰，培育期間晝夜光照同自然條件，盡可能形成山澗流水環(huán)境來模仿蝌蚪的自然生長條件。

1.3 組織學(xué)制片

設(shè)一組自然水溫(23±1)℃中生長的蝌蚪，定期取樣，制作組織石蠟切片，觀察棘胸蛙早期性腺的形成和性腺分化。從第2天開始，觀察蝌蚪長勢及形態(tài)，參照Gosner[16]分期，每3—5 d取樣6尾，共取26組樣。切去蝌蚪尾巴及透明口部，留下蝌蚪軀干部，投入FAA液固定組織，常規(guī)梯度乙醇脫水，環(huán)保型生物透明劑TO透明，石蠟包埋，制作連續(xù)橫切片和縱切片，切片厚6—8 μm，HE染色。切片標本置OLYMPUS BX51顯微鏡(配冷光源數(shù)碼相機OLYMPUS DPT0)下觀察、拍照。

1.4 溫度實驗

隨機分配同一批次剛孵出蝌蚪(Gosner 24期)成4組(無重復(fù))，每組100只，放入預(yù)先整理好的自制培養(yǎng)箱(100 cm×30 cm×50 cm)中，設(shè)置(16±1)℃、(27±1)℃、(31±1)℃ 3個溫度實驗組；(23±1)℃為對照組。實驗組(16±1)℃水溫低于自然水溫，用冷水機制冷控溫；實驗組(27±1)℃、(31±1)℃水溫高于自然水溫，用可控溫加熱棒進行控溫。孵化后2天開始進行溫度處理，為了保證蝌蚪正常生長，實驗過程中要盡力保證水溫的可控內(nèi)變化。

通過連續(xù)切片后找到可以鑒別性別的蝌蚪發(fā)育時期，對各實驗組和對照組隨機取樣同一變態(tài)發(fā)育時期的蝌蚪進行性腺切片觀察性腺，并統(tǒng)計雄性率，雄性率=(雄性蝌蚪數(shù)/取樣蝌蚪數(shù))×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)分析前，檢驗正態(tài)分布性，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用單因素方差(one-way Anova)分析差異顯著性，實驗組蝌蚪的雄性率與對照組的差異顯著性用卡方檢驗(2)進行，所有統(tǒng)計分析均在SPSS 18.0軟件中運行，置信水平設(shè)為α<0.05。

圖1 17 d (Gosner 25期)蝌蚪未分化生殖腺切片 Fig.1 Undifferentiated gonadal slices in day 17 (Gosner stage 25) tadpoleAc：腹腔，abdominal cavity；Da：背主動脈，dorsal aorta；F：脂肪體，fat body；GR：生殖嵴，germinal ridge；M：中腎，mesonephros；Md：中腎管，mesonephric duct；PGC：原生殖細胞，primordial germ cell

2 結(jié)果

2.1 棘胸蛙早期性腺分化

2.1.1 未分化生殖腺

剛孵化出17 d蝌蚪(Gosner 25期)，全長(23.40±0.5) mm。石蠟橫切面位于脊柱旁腎臟靠體腔部位，在背大動脈腹膜上皮的左右兩側(cè)，各向腹腔突出形成1對縱行隆起(圖1)，圖中左側(cè)隆起結(jié)構(gòu)中無腔隙，只由原生殖細胞(Primordial germ cells，PGCs)和體細胞構(gòu)成，此結(jié)構(gòu)為生殖嵴(Germinal ridge)；圖中右側(cè)隆起結(jié)構(gòu)中有一個小腔隙，為初生性腔(Primary cavity)，且在性腔表面有層扁平上皮，腔隙上皮周圍包圍著原生殖細胞和體細胞，此結(jié)構(gòu)為原始性腺(Primordial gonad)。

2.1.2 卵巢的分化

44 d蝌蚪(Gosner 25期)，全長(36.71±0.5) mm。蝌蚪吃食量增大，體重體長有所增加，后肢芽尚未發(fā)育，仍處于Gosner 25期。此時在蝌蚪橫切標本中可觀察到，原始性腺中初生性腔周圍的單層扁平上皮逐漸消失，為次生性腔(Secondary cavity)，性腔周圍出現(xiàn)卵原細胞(圖2)，外圍包裹著部分還未分化的原生殖細胞。此時期的卵原細胞呈圓形或橢圓形，細胞和細胞核的直徑分別約為40 μm和25 μm，核內(nèi)有明顯染色絲，著色程度較細胞質(zhì)深。

60 d蝌蚪(Gosner 25期)，全長(42.44±0.5) mm。蝌蚪后肢芽仍沒有發(fā)育。此時蝌蚪橫切標本中可觀察到的一對卵巢位于中前腎靠近中央的腹面，卵巢由卵原細胞、初級卵母細胞和最外層體細胞構(gòu)成，次生性腔保留。初級卵母細胞體積較大，著色較深，核中出現(xiàn)多個核仁和明顯的染色質(zhì)絲(圖2)。

在Gosner 40—45期，絕大部分蝌蚪變態(tài)發(fā)育明顯，初具幼蛙形態(tài)，到第126天(Gosner 46期)，已有部分蝌蚪經(jīng)完全變態(tài)長成幼蛙。幼蛙卵巢呈長囊狀，有分葉現(xiàn)象。卵巢中初級卵母細胞體積增大，數(shù)目增多(圖2)。

圖2 蝌蚪卵巢分化切片圖Fig.2 Ovary differentiation slices of tadpolea：44 d (Gosner 25期)蝌蚪過中腎橫切面；b：60 d(Gosner 25期)蝌蚪卵巢橫切面；c：完成變態(tài)幼蛙(Gosner 46期)卵巢橫切面;Ac：腹腔，abdominal cavity；Da：背主動脈，dorsal aorta；F：脂肪體，fat body；G：消化道，gut；M：中腎，mesonephros；Md：中腎管，mesonephric duct；Mu：肌肉，muscle；O：卵巢，ovary；Oo：卵原細胞，oogonium；Po：初級卵母細胞，primary oocyte；Sp：脊柱，spine；Sc：次生性腔，secondary cavity；Vi：內(nèi)臟，viscera

2.1.3 精巢的分化

52 d蝌蚪(Gosner 25期)，全長(40.12±0.5) mm。原始性腺中初生性腔逐漸擴大，位于性腔周圍的扁平上皮消失，性腔中可觀察到體細胞，部分原始生殖細胞開始分化成精原細胞，這時期的原始性腺可稱作精巢(圖3)。

68—80 d蝌蚪(Gosner 25—26期)，切片發(fā)現(xiàn)初生性腔中，體細胞數(shù)目增多，腔隙逐漸減小，最終消失。部分處于分裂增殖期的精原細胞組成精小囊(Spermatogenic cyst)(圖3)，精巢分化為內(nèi)在的髓質(zhì)部和外面的皮質(zhì)部。

在Gosner 40—42期，蝌蚪前肢長出。精巢呈長橢圓形，體積增大，表面光滑，分葉現(xiàn)象不存在。精巢的髓質(zhì)部主要為體細胞；皮質(zhì)部主要為精原細胞(圖3)。精原細胞核外細胞質(zhì)較少，著色較淺，細胞核較大，核膜清晰，核中出現(xiàn)1—2個核仁。精原細胞比卵原細胞小很多。

圖3 蝌蚪精巢分化切片圖Fig.3 Testis differentiation slices of tadpolea：52 d(Gosner 25期)蝌蚪過中腎橫切面；b：70 d(Gosner 26期)蝌蚪過中腎橫切面；c：完成變態(tài)的幼蛙(Gosner 46 期)精巢橫切面;Da：背主動脈，dorsal aorta；F：脂肪體，fat body；M：中腎，mesonephros；Md：中腎管，mesonephric duct；Mu：肌肉，muscle；S：體細胞，somatic cells；Sg：精原細胞，spermatocyte；T：精巢，testis

2.1.4 分化異?，F(xiàn)象

切片中部分性腺結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，如22℃實驗組完成變態(tài)幼蛙(Gosner 46期)、30℃實驗組(Gosner 30期)及27℃實驗組(Gosner 26期)中均存在精巢中央腔隙未完全消失現(xiàn)象，精巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)與卵巢相似(圖4)；27℃實驗組(Gosner 26期)有一些個體存在3個性腺(圖4)；27℃實驗組(Gosner 26期)與30℃實驗組完成變態(tài)幼蛙(Gosner 46期)部分個體出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象(圖4)，性腺為一側(cè)卵巢一側(cè)精巢。

圖4 蝌蚪畸形性腺切片F(xiàn)ig.4 Gonad malformations slices of tadpolea：22℃實驗組完成變態(tài)幼蛙(Gosner 46期)過精巢縱切面；b：27℃實驗組完成變態(tài)幼蛙(Gosner 46期)精巢橫切面，一個個體中同時觀察到三個精巢切面；c：27℃實驗組(Gosner 26期)過性腺橫切面，一側(cè)性腺為精巢,另一側(cè)含有卵原細胞的精巢；d：30℃實驗組(Gosner 30期)過性腺橫切面，兩側(cè)都為含有卵原細胞的精巢；e：30℃實驗組完成變態(tài)幼蛙(Gosner 46期)過性腺橫切面，一側(cè)性腺為精巢,另一側(cè)為含有卵原細胞的精巢;Ac：腹腔，abdominal cavity；Da：背主動脈，dorsal aorta；F：脂肪體，fat body；G：消化道，gut；M：中腎，mesonephros；Oo：卵原細胞，oogonium；Sc：次生性腔，secondary cavity；Sg：精原細胞，spermatocyte；T：精巢，testis；Vi：內(nèi)臟，viscera

2.2 溫度對棘胸蛙雌雄性比例的影響

對各實驗組和對照組隨機取樣(n=50)同一變態(tài)發(fā)育時期(Gosner 42期)的蝌蚪進行性腺切片觀察性腺，并統(tǒng)計雄性率。統(tǒng)計結(jié)果顯示：(23±1)℃對照組的雌、雄比例為26∶24；(16±1)℃實驗組的雌、雄比例為33∶17；(27±1)℃實驗組的雌、雄比例為19∶31；(31±1)℃實驗組的雌、雄比例為15∶35 (表1)。

表1 不同溫度對棘胸蛙性比的影響

3 討論

3.1 棘胸蛙性腺分化的特點

棘胸蛙性腺分化的特點與所描述的其他兩棲蛙類基本相同，但也存在一定的差異。棘胸蛙的原始性腺分化后，中央都會出現(xiàn)初生性腔的結(jié)構(gòu)，初生性腔的外周有PGCs分布(圖1)，這與澤蛙(Ranalimnocharis)的性腺分化相似[5]。然而，棘胸蛙的初生性腔含有一層扁平上皮組織，在形成次生性腔后會逐漸消失，這與澤蛙的情況正好相反。在初生性腔上，當單層扁平上皮逐漸消失形成次生性腔，且性腔周圍的PGCs長大至2—3倍時，性腺開始分化成為卵巢，卵巢中的原生殖細胞開始分化為卵原細胞(圖2)；而形成了次生性腔且體細胞滲入性腔中，導(dǎo)致腔隙縮小消失的原始性腺將會發(fā)育成精巢，其中的原生殖細胞分化成為精原細胞(圖3)。所以，原始性腺分化為卵巢或者精巢不能單從原始的性腺有沒有形成腔隙來進行判別，分化為卵巢與否也不能從是否形成次生性腔來判斷。不同于之前所提到的兩種分化特征，兩棲類動物的性腺分化中仍存在其他特殊的類型，具有不同的分化特征，例如短吻蛙(Ranacurtipes)的原始性腺會先發(fā)育變?yōu)榫哂兄醒肭坏穆殉?，而后卵巢中的部分卵母細胞會逐漸退化，卵巢中央腔被體細胞滲透，轉(zhuǎn)變成了精巢[17]。這與在高溫和有雄性激素的情況下，棘胸蛙存在的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象相似(圖4)。

另外，棘胸蛙性腺開始分化的時期也與已報道的兩棲蛙類不同。棘胸蛙卵巢的分化從開始出現(xiàn)卵原細胞到形成卵巢都在25期，沒有出現(xiàn)后肢芽的發(fā)育(26期)。中國林蛙性腺開始分化的時期為31期，原因是林蛙胚胎在31期時形成初級卵母細胞[4]。澤蛙的卵巢則是從32期開始分化[5]。性別分化以后，卵巢發(fā)育速度較快，26期時已基本分化完全，而精巢發(fā)育速度較慢，精巢結(jié)構(gòu)從26期時才開始形成，直至42期結(jié)束。這比澤蛙和林蛙分化完成的時期都要早，這可能與棘胸蛙較長的生活周期有關(guān)。

3.2 溫度對棘胸蛙性腺分化的影響

研究表明，大部分兩棲動物高溫能誘導(dǎo)雄性化，低溫度能誘導(dǎo)雌性化[5,18- 19]。本研究表明，棘胸蛙在(23±1)℃自然水溫下培育，雄性率為48%，接近50%；(16±1)℃下，雄性率偏低，為34%；(31±1)℃下，雄性率顯著升高至70%(P<0.05)，即棘胸蛙的性別決定為溫度依賴型性決定(TSD)，高溫有利于蝌蚪雄化。這與其他幾種兩棲類的研究結(jié)果相似[5,18- 19]。例如，歐非肋突螈和滯育小鯢幼體進行高溫暴露后得到的全部為雄性個體[20- 21]。楊干榮等[22]研究結(jié)果顯示，性腺處于未開始性分化時的娃娃魚(Andriasdavidianus)仔體在18—25℃水溫下培育，雌雄比幾乎為1∶1，8—16℃下，雄性率為22%，28—31℃下，雄性率高達88%。金梅[23]與李新紅等[5]在對中國林蛙性別分化的研究中也得出了相似結(jié)論。

關(guān)于溫度敏感期，棘胸蛙與其他兩棲動物有顯著不同。李桑等[5]研究顯示澤蛙性分化的溫度敏感時期為蝌蚪Gosner 26—38期，李新紅研究顯示中國林蛙性分化的溫度敏感時期始于30期。本研究結(jié)果顯示棘胸蛙蝌蚪于17天(Gosner 25期)形成原始性腺，44天(Gosner 25期)初生性腔周圍出現(xiàn)卵原細胞，在68—80天(Gosner 25—26期)精巢結(jié)構(gòu)形成，由此可推測棘胸蛙性分化的溫度敏感期可能為第17—80天(Gosner 25—26期)，時期間隔短但時間跨度較長。

此外，本實驗中有部分蝌蚪出現(xiàn)3個性腺，還有部分蝌蚪呈現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象，其表現(xiàn)為兩側(cè)性腺分別為精巢組織結(jié)構(gòu)與含有初級卵母細胞的精巢結(jié)構(gòu)。該現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是高溫培育致使蝌蚪性腺正處于卵巢向精巢轉(zhuǎn)化的過渡時期，但隨蝌蚪性腺分化，雌雄同體現(xiàn)象也可能不會消失。雌雄同體現(xiàn)象在澤蛙[5]和性逆轉(zhuǎn)的泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)個體[2]也有存在。