奶牛常用飼料中亞硝酸鹽含量的測定與分析

張曉紅，王志琴，劉英玉，鄭小風 ，陳俐靜，姚 剛

（新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052）

各類飼料是人類的朋友-動物的“食糧”，也是我們間接的食品。因此，飼料的質(zhì)量和安全與否直接關(guān)系到畜產(chǎn)品如肉、奶、蛋、魚等的高效生產(chǎn)和動物性產(chǎn)品的安全衛(wèi)生。目前，世界各地都非常重視飼料衛(wèi)生與安全[1]。

硝酸鹽一般存在于飼料、食品和我們生存的環(huán)境中，硝酸鹽本身基本上屬于無毒，當還原成亞硝酸鹽時便有了毒性[2]。它大多數(shù)儲存在植物體內(nèi)，其含量高低幅度變化很大。不僅僅與植物的種類、品種、植株不同部位和各個生育階段有關(guān)系，而且還和外部環(huán)境如土壤肥料、水分、溫度、光照等具有密切相關(guān)性[3]。飼料中亞硝酸鹽主要有硝酸鹽轉(zhuǎn)化而來。亞硝酸鹽是一種較強的氧化劑，能把血液中的二價鐵氧化成三價鐵，從而成為高鐵血紅蛋白，使血紅蛋白不能與氧結(jié)合，喪失了攜氧功能，導致機體組織缺氧短時間內(nèi)造成呼吸中樞麻痹，造成機體窒息導致死亡[4]。一般情況下，植物類的飼料亞硝酸鹽的含量非常低，動物性飼料如魚粉中的亞硝酸鹽含量雖然很高，但是也在國家飼料衛(wèi)生標準規(guī)定允許的范圍內(nèi)[5]。但青綠飼料，如未成熟的綠燕麥、大麥、小麥、蘇丹草、玉米秸稈、高粱秸稈和根莖類飼料等富含硝酸鹽，如果飼料儲存條件不合適或者處理方法不適當就可導致亞硝酸鹽含量急劇增長，結(jié)果引起動物的中毒[6]。中毒患牛精神沉郁、過度流涎、站立不穩(wěn)、可視粘膜紫紺，變成藍紫色；呼吸困難、心跳快而弱；肌肉震顫、瞳孔散大；瘤胃鼓氣、常有腹痛狀；尿頻、體溫下降直至窒息死亡[7]。

在現(xiàn)代化集約栽培工藝的條件下,飼料作物的用地施肥數(shù)量劇增。施用的大量的無機肥例如氮肥,使得植物體內(nèi)積累了非蛋白氮:硝酸鹽、經(jīng)胺、亞硝酸鹽、氨、亞硝胺等。硝酸鹽和亞硝酸鹽含量有可能高于人和牲畜最大允許量，這些化合物在動物的器官、組織和乳液內(nèi)濃度也逐漸會增加，降低牛奶品質(zhì)，造成一定的經(jīng)濟損失[8]。奶制品會引起人體內(nèi)亞硝酸鹽含量過高，尤其值得一提的是，高劑量的亞硝酸鹽會產(chǎn)生比較大的毒性。如果誤食了亞硝酸鹽是會導致亞硝酸鹽類的食物中毒，長期食用甚至會引發(fā)人類患胃癌、食道癌[9]。

飼料中亞硝酸鹽含量的測定常采用重氮偶合比色法。根據(jù)使用的試劑不同又分為α-萘胺法和鹽酸萘乙二胺法[10]。本次試驗是根據(jù)奶牛場提供飼料，以檢測飼料中亞硝酸鹽含量是否超標。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集與處理

采集有代表性的樣品，采集稻草飼料、天康飼料、青貯飼料、精飼料、糖渣、苜蓿各1 kg，分別編號，取樣約100 g，粉碎，過1 mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器與試劑

分光光度計、小型粉碎機、分析天平、恒溫水浴鍋，一般玻璃儀器。

硫酸鋅溶液（0.42 mol/L）、氫氧化鈉溶液（20 g/L)、60%乙酸溶液量。氯化銨緩沖液：1 000 mL容量瓶中加人500 mL水，加入20 mL鹽酸，混勻，加人50 mL氫氧化銨，用水稀釋至刻度。用稀鹽酸和稀氫氧化銨調(diào)節(jié)pH至9.6～9.7。對氨基苯磺酸溶液:稱取5 g對氨基苯磺酸，溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中，置棕色瓶保存，1周內(nèi)有效。鹽酸-萘乙二胺溶液(1 g/L):稱取0.1 g鹽酸-萘乙二胺，加醋酸溶解并稀釋至100 mL，混勻后置棕色瓶中，在冰箱內(nèi)保存，1周內(nèi)有效。顯色劑的配置使用之前將0.1%鹽酸-萘乙二胺溶液和對0.4%氨基苯磺酸溶液等體積混合。亞硝酸鈉標準溶液:稱取250 mg經(jīng)115℃±50℃烘至恒重的亞硝酸鈉，加水溶解，移入500 mL容量瓶中，加100 mL氯化銨緩沖液，加水稀釋至刻度，混勻，在40℃避光保存此溶液每毫升相當于500 μg亞硝酸鈉。亞硝酸鈉標準工作液使用前，精確吸取亞硝酸鈉標準溶液1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋到刻度，此溶液每毫升相當于5.0 μg亞硝酸鈉。

1.2 飼料中亞硝酸鹽的測定（比色法）GB/T 13085-2005試驗方法

1.2.1 試驗原理

樣品在弱堿性條件下除去蛋白質(zhì)，在弱酸性條件下待測樣品中的亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生化學反應(yīng)，生成重氮化合物，再和鹽酸-萘乙二胺發(fā)生偶合反應(yīng)，形成紫紅色化合物，進行比色[11]。

1.2.2 試液制備發(fā)生

稱取約20 g試樣，精確到0.001 g，置于200 mL燒杯中，加70 mL水和1.2 mL氫氧化鈉溶液,混勻，用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH為8～9，全部轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，加10 mL醋酸鋅溶液，混勻 ，產(chǎn)生沉淀為止，混勻，放置60℃水浴中加熱10 min，加蒸餾水至刻度，混勻。放置0.5 h，用濾紙過濾，棄去初濾液20 mL，濾液備用。

1.2.3 亞硝酸鹽標準曲線的繪制

吸取0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL亞硝酸鈉標準工作液 (相當于0,2.5,5,10,15,20,25 kg亞硝酸鈉)，放置于25 mL比色管中。 加2.5 mL乙酸后立即加人5.0 mL顯色劑，加蒸餾水到刻度，混勻，在避光處靜置25 min，用零管調(diào)節(jié)零點，在波長538 nm處測吸光度AO值，吸光度為縱坐標，各溶液中所含亞硝酸鈉質(zhì)量為橫坐標，繪制標準曲線或計算回歸方程。

含亞硝酸鹽低的試樣以制備低含量標準曲線計算，標準系列為:吸取0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 mL亞硝酸鈉標準工作液(相當于0,2,4,6,8,10 μg亞硝酸鈉)。

1.2.4 測定

吸取10.0 mL上述試液于25 mL容量瓶中，按亞硝酸鹽標準曲線的制備中從“分別加入4.5 mL氯化銨緩沖液”起，進行顯色和測量試液的吸光度(A1)。精確吸取10.0 mL試液加入25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，用蒸餾水來調(diào)節(jié)零點，測定其吸光度(A0)。從試液吸光度值A(chǔ)1中減掉吸光度值A(chǔ)0后得到吸光度值A(chǔ)，A=A1-A0,再將A代人回歸方程進行計算。

1.2.5 亞硝酸鹽標準曲線（見表1、圖1）

表1 亞硝酸鹽標準曲線

圖1 亞硝酸鹽標準曲線

1.2.6 計算公式

式中：X----樣品中的亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）含量，單位為mg/kg；

m1---樣樣質(zhì)量，單位為g；

m2----測定用樣液中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的質(zhì)量，單位為μg；

V1----樣品處理液的總體積，單位為mL；

V2-----測定用樣品液體積，單位為mL；

1000-----單位換算系數(shù)。

本實驗中，m1為 10 g；V1為 200 mL；V2為 10 mL；所以公式可改寫為：X=2m2[12]

1.3 飼料中亞硝酸鹽允許量（見表2）

表2 飼料衛(wèi)生標準亞硝酸鹽允許量值

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中亞硝酸鹽的測定結(jié)果

六種飼料中亞硝酸鹽含量的測定結(jié)果見圖2和表3，在本次試驗測定后，六種飼料亞硝酸鹽含量各不相同，但均未超標，符合國家標準[13]要求。其中含量最高的為精飼料：6.83 mg/kg，含量最低的是糖渣：0.20 mg/kg，稻草飼料亞硝酸鹽含量也相對較高。精飼料亞硝酸鹽含量高可能在于飼料中種類繁雜，同時顏色也會對最后結(jié)果的測定產(chǎn)生影響；而稻草飼料和苜蓿亞硝酸鹽含量相對較高，可能是在飼料干燥期間硝酸鹽含量會增長，陰雨天或者陽光照射不足時也會造成光合作用的減弱，使得氮富集。另外，大量的施用氮肥、土壤中缺少鉬元素、過度施用除草劑或者病蟲害會造成硝酸鹽的累積，在各類微生物的共同作用下，硝酸鹽很容易轉(zhuǎn)換成亞硝酸鹽。

圖2 飼料中亞硝酸鹽含量分析圖

表3 六種飼料中亞硝酸鹽含量的測定結(jié)果

2.2 試驗中注意事項

2.2.1 樣液的處理

樣液制備完成后如果不能及時用分光光度計測定其吸光度，一定要注意密閉、避光和低溫保存，避免硝酸鹽和亞硝酸鹽很快發(fā)生氧化還原反應(yīng)，務(wù)必要保持樣品的重現(xiàn)性和完整性。

2.2.2 顯色劑的處理方法

對氨基苯磺酸溶液和鹽酸-萘基乙二胺溶液配制時要用酸性溶液(鹽酸或乙酸溶液)保證它的穩(wěn)定性。試劑配置好后馬上分裝于棕色試劑瓶低溫密閉保存。 使用時，根據(jù)需要配制（使用時間不超過7 d）。使用前將二者等體積混勻，這樣顯色會更加充分。

2.2.3 亞硝酸鈉標準溶液的處理

亞硝酸鈉吸濕性比較強，在空氣中很容易被氧化成硝酸鈉，所以亞硝酸鈉要放在硅膠干燥器中干燥24 h或者經(jīng)115±5℃真空干燥到恒重。配好的標準液放置于4℃冰箱密閉保存。

2.2.4 確定加熱時間

加熱是為了更好地除去脂肪、沉淀蛋白質(zhì)，除去遮蔽因素。如果加熱時間太短，蛋白質(zhì)沉淀劑不能很充分的與樣品發(fā)生反應(yīng)，時間太長使得亞硝酸鹽分解成氧化氮和硝酸，使得測定結(jié)果偏低。所以為減小試驗誤差要控制好加熱時間。

3 結(jié) 論

本試驗應(yīng)用國家標準GB/T 13085-2005方法，對奶牛常見飼料中亞硝酸鹽的含量進行了測定與分析，結(jié)果表明：六種常見飼料中都含有亞硝酸鹽，但含量均未超出國家標準，相比之下精飼料亞硝酸鹽含量最高：6.83 mg/kg，糖渣內(nèi)亞硝酸鹽含量較低。因此，應(yīng)嚴格控制生產(chǎn)飼料過程中硝酸鹽亞硝酸鹽的累積，減少各類含硝酸鹽亞硝酸鹽添加劑的用量，以確保飼料質(zhì)量。