高鈣和缺鈣環(huán)境對(duì)花鰻鱺血液生理指標(biāo)及其NCXs和PMCAs基因表達(dá)的影響

曹全全，胡亞東，王 濤，張宏葉，顧 杰，王 丹，李欣茹，尹紹武

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210023；2.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

花鰻鱺（Anguilla marmorata）屬鰻鱺目（Anguilliformes），鰻鱺科（Anguillidae），鰻鱺屬，廣泛分布于太平洋周圍的熱帶和亞熱帶區(qū)域，為降海洄游性魚類。因其肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩，市場(chǎng)需求大，導(dǎo)致捕撈過度，被《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》列為瀕危物種，并于上20世紀(jì)90年代被我國列為二級(jí)保護(hù)動(dòng)物［1］。在自然條件下，鰻鱺因具特殊的生活史洄游于淡水和海水之間且頻繁地面對(duì)滲透壓的挑戰(zhàn)。鹽度和鈣離子濃度是影響魚類滲透壓最重要的兩個(gè)外界指標(biāo)［2］。鈣離子是海水中的重要組成部分之一，且其濃度在海水表層與深水中變動(dòng)較大，而在魚體內(nèi)卻維持在一個(gè)較窄的范圍內(nèi)［3］。因此維持鈣穩(wěn)態(tài)對(duì)于鰻鱺屬魚類來說具有重要的意義。

鈉鈣交換體NCX是一種膜內(nèi)在蛋白［4］，其中NCX1、NCX2和NCX3這3種亞型已在哺乳動(dòng)物如 鼠 （Rattus norvegicus）［5］、豚 鼠 （Cavia porcellus）［6］和狗（Canis lupus familiaris）［7］中克隆得到。NCX1在機(jī)體組織中廣泛分布，而NCX2和NCX3主要分布于腦和骨骼肌中［8］。在魚類研究中，NCX1在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［9］、莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）［10］和斑馬魚（Barchydanio rerio）［11］等魚類中已被克隆。NCX的主要功能是將鈣離子從細(xì)胞內(nèi)排出以防止胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣離子超負(fù)荷輸出，從而維持胞漿中鈣離子濃度的恒定［12］。質(zhì)膜 Ca2＋泵（PMCA）是一種Ca2＋-Mg2＋-ATP酶，通過水解ATP來維持Ca2＋的輸出從而達(dá)到維持細(xì)胞低濃度鈣離子的目的。PMCA包含10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、5個(gè)推測(cè)的胞外域和3個(gè)主要細(xì)胞結(jié)構(gòu)域蛋白。這些結(jié)構(gòu)域均屬于功能位點(diǎn)，是鈣離子綁定位點(diǎn)，被鈣調(diào)蛋白激活；也是ATP綁定位點(diǎn)，對(duì)于酰基磷酸酐的形成和水解有著重要的作用［12－13］。人類PMCA分為4個(gè)亞型，分別為 PMCA1、2、3和4。PMCA1和 PMCA4在哺乳動(dòng)物中具有廣泛分布，被譽(yù)為維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的看家亞型，而PMCA2和PMCA3的表達(dá)模式具有組織特異性［14］。

鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體NCX、PMCA等通過上皮細(xì)胞Ca2＋的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)，來控制鈣離子進(jìn)出體內(nèi)的凈含量，進(jìn)而影響多個(gè)生理學(xué)進(jìn)程。此外，鈣離子的循環(huán)量受到機(jī)體嚴(yán)格的限制，魚類需具備感知外界鈣離子的能力進(jìn)而調(diào)節(jié)鈣離子的穩(wěn)態(tài)［15］。在哺乳動(dòng)物的腎臟中，鈣離子通過鈣通道透過質(zhì)膜，然后依托鈣結(jié)合蛋白擴(kuò)散穿出質(zhì)膜［16］。FLIK等［17］在魚鰓中提出一個(gè)模型，與哺乳動(dòng)物腎臟鈣離子的重吸收相似，Ca2＋依附胞液鈣結(jié)合蛋白從胞液排出到血液中，需細(xì)胞底外側(cè)PMCA和NCX以及頂膜鈣離子泵（ECaCs）的參與，但關(guān)于這些鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)整個(gè)鈣離子吸收進(jìn)程的相對(duì)重要性并沒有闡述。

為了探究花鰻鱺NCXs和PMCAs基因在極性鈣環(huán)境下（高鈣10 mM和缺鈣0 mM）的表達(dá)規(guī)律，本研究測(cè)量了花鰻鱺成鰻從對(duì)照組轉(zhuǎn)移到高鈣組和缺鈣組時(shí)的血清鈣濃度、血清滲透壓和5項(xiàng)血液指標(biāo)（白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、葡萄糖濃度、血紅蛋白濃度和血小板數(shù)目），并采用qRTPCR技術(shù)對(duì)NCXs和PMCAs基因在花鰻鱺13種不同組織（腦、鰓、頭腎、后腎、前腸、中腸、后腸、肝、心、肌肉、鰾、脾和皮膚）中的表達(dá)進(jìn)行了分析，最后研究了花鰻鱺應(yīng)對(duì)極性鈣濃度下（高鈣10 mM和缺鈣0 mM）NCXs和PMCAs基因在鰓組織中的mRNA表達(dá)水平變化規(guī)律。以期為進(jìn)一步解析花鰻鱺鈣穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

花鰻鱺體質(zhì)量（550±10）g，取自中國海南文昌金山花鰻鱺科技有限公司（公司具有中華人民共和國水生動(dòng)物捕撈資格），暫養(yǎng)于玻璃循環(huán)缸中15 d，每日定期投喂飼料，攝食30 min后虹吸排污，每日換1／3水體。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣24 h的自來水，養(yǎng)殖水溫保持在25～27℃。確定魚體健康無病后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

用北京百泰克公司的高純總RNA快速抽提試劑盒（離心柱型）提取花鰻鱺組織總RNA，用RNA濃度測(cè)定儀測(cè)定每個(gè)樣品的RNA濃度及純度，確保 OD 260／280在1.9～2.1范圍內(nèi)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。所有樣品凍存于－80℃冰箱中備用。以總RNA為模板，根據(jù) HiScriptTM1ST strand cDNA Synthesis kit（南京諾唯贊生物科技有限公司）的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈。

1.3 花鰻鱺NCXs和PMCAs基因的組織表達(dá)分析

隨機(jī)取缸內(nèi)3尾花鰻鱺成鰻，MS-222（Sigma）（150 mg·L－1）麻醉后解剖取 13種組織（腦、鰓、頭腎、后腎、前腸、中腸、后腸、肝、心、肌肉、鰾、脾和皮膚），提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。根據(jù)花鰻鱺轉(zhuǎn)錄組及其近緣物種的NCXs和PMCAs序列，分別用Primer 5設(shè)計(jì)特異性引物 NCX1-F、NCX1-R、NCX2-F、NCX2-R、NCX3-F、 NCX3-R、 PMCA2-F、 PMCA2-R、PMCA4-F、PMCA4-R以及作為內(nèi)參基因的花鰻鱺actin基因特異性上下游引物actin7、actin8（表1）。以獲得的13種組織的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分別檢測(cè)花鰻鱺 NCXs和PMCAs在13種組織中mRNA的表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系為20μL：Faststart Universal SYBR Green Master 10μL，正反引物（2μmol·μL－1）各3μL，cDNA模板（5 ng·μL－1）4μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸5 min，4℃保存。

表1 花鰻鱺NCXs和PMCAs基因熒光定量的引物Tab.1 Primers used for Anguilla marmorata NCXs and PMCAs in qRT-PCR

1.4 人工鈣離子水的配置

參照CHEN等［18］所描述的鈣離子溶液的配置方法，用 CaSO4、MgSO4、NaCl、K2HPO4、KH2PO4和去離子水（Milli-RO60，Millipore，Bedford，MA）配置不同鈣梯度的水溶液。實(shí)驗(yàn)鈣濃度分為：1）組 A：對(duì)照組（pH＝7，2 mM Ca2＋）；2）組B：缺鈣組（pH＝7，0 mM Ca2＋）；3）組 C：高鈣組（pH＝7，10 mM Ca2＋），其它3種溶液的鈣離子濃度相同（［Na＋］，0.5 mM；［Mg2＋］，0.16 mM；［K＋］，0.3 mM）。實(shí)驗(yàn)用魚先放置在組A中馴化1周，1周后把魚放置到組B和組C中進(jìn)行相關(guān)的時(shí)序表達(dá)實(shí)驗(yàn)。為保持水中鈣濃度穩(wěn)定，每6 h換1次相應(yīng)濃度的鈣離子水，換水量為50%，實(shí)驗(yàn)過程中持續(xù)充氧。

1.5 Ca2＋脅迫對(duì)花鰻鱺NCXs和PMCAs基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探究花鰻鱺在不同鈣脅迫下、不同時(shí)段的鰓組織中NCXs和PMCAs基因表達(dá)水平的變化規(guī)律，實(shí)驗(yàn)各組分別于第1、4和7天，每個(gè)缸內(nèi)隨機(jī)取3尾魚，用MS-222（Sigma）麻醉，取其鰓組織，液氮速凍10 min后于－80℃保存。隨即用注射器經(jīng)主動(dòng)脈抽出血液，靜置后取血清，用原子吸收光譜法（SpectrAA-220FS，Varian，US）測(cè)量鈣離子濃度。血清滲透壓用蒸汽壓滲透壓計(jì)（Wescor，5500XR，Logan，UT）測(cè)量其滲透壓值。用自動(dòng)血液分析儀（BC-2800vet，Manrui，China）測(cè)量紅細(xì)胞數(shù)目、白細(xì)胞數(shù)目和血小板數(shù)目。葡萄糖濃度和血紅蛋白濃度用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒測(cè)定（Jiancheng Bioengineering，Nanjing，China）。提取鰓組織總RNA并檢測(cè)NCXs和PMCAs基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示。采用 2－ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理［21］。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23對(duì)時(shí)間和鈣離子濃度進(jìn)行雙因子方差分析（two-way ANOVA）（表2），組織表達(dá)用單因子方差分析（one-way ANOVA），通過t檢驗(yàn)計(jì)算P值，若P＜0.05，則差異顯著。用Origin 8.6繪制柱狀圖。

表2 時(shí)間和鈣離子濃度的雙因素分析Tab.2 Two-way ANOVA of time and Ca2＋concentration

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鈣離子脅迫下花鰻鱺血清鈣濃度和血清滲透壓的變化規(guī)律

如圖1所示，血鈣濃度（圖1－A）和血清滲透壓（圖1－B）與周圍鈣濃度成正相關(guān)。在高鈣離子環(huán)境中，血鈣濃度和血清滲透壓隨著時(shí)間的延長成下調(diào)趨勢(shì)；在缺鈣環(huán)境中，血鈣濃度和血清滲透壓隨著時(shí)間的增加成上調(diào)趨勢(shì)。3種鈣濃度組血鈣濃度和血清滲透壓在第7天差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同鈣離子濃度下對(duì)花鰻鱺血液學(xué)指標(biāo)的影響

如圖2所示，白細(xì)胞數(shù)目（圖2－A）、紅細(xì)胞數(shù)目（圖2－B）、血小板數(shù)目（圖2－C）、血紅蛋白濃度（圖2－D）和葡萄糖濃度（圖2－E）和周圍鈣濃度成正相關(guān)。在高鈣與缺鈣環(huán)境中，白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、葡萄糖濃度、血紅蛋白濃度和血小板數(shù)目隨著時(shí)間的延長成下調(diào)趨勢(shì)，且較對(duì)照組在第1、4天具有顯著性差異（P＜0.05）。而在第7天白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、葡萄糖濃度、血紅蛋白濃度和血小板數(shù)目各組的差異并不顯著（P＞0.05）。

2.3 NCXs和PMCAs基因在花鰻鱺不同組織表達(dá)分布

qRT-PCR結(jié)果顯示（圖3），NCXs和 PMCAs基因在花鰻鱺腦、鰓、頭腎、后腎、前腸、中腸、后腸、肝、心、肌肉、鰾、脾和皮膚這13種組織中均有表達(dá)，具有廣泛表達(dá)的特點(diǎn)。其中，花鰻鱺NCX1（圖3－A）和 PMCA4（圖3－E）基因在頭腎中表達(dá)量最高，NCX2（圖3－B）和 NCX3（圖3－C）在皮膚中表達(dá)量最高，PMCA2（圖3－D）在后腎中表達(dá)量最高，而在前腸中5個(gè)基因表達(dá)量則最低。

2.4 不同鈣處理、不同時(shí)段下花鰻鱺NCXs和PMCAs基因的表達(dá)模式

在急性高鈣脅迫下，花鰻鱺NCX1（圖4－A）和PMCA4（圖5－B）基因在鰓組織的mRNA表達(dá)在第1天均顯著上調(diào)；在缺鈣環(huán)境中，其mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)。對(duì)于NCX1基因，隨著適應(yīng)時(shí)間的延長，在第4天和第7天高鈣環(huán)境下的mRNA表達(dá)量顯著上升，而在缺鈣環(huán)境中mRNA表達(dá)量顯著降低，在第7天各處理組差異顯著（P＜0.05）；對(duì)于 PMCA4，隨著適應(yīng)時(shí)間的延長，在第4天和第7天高鈣環(huán)境下PMCA4基因的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，而在缺鈣環(huán)境中mRNA表達(dá)上調(diào)，在第7天各處理組無顯著差異（P＞0.05）。但對(duì)于 NCX2（圖 4－B）、NCX3（圖 4－C）和PMCA2（圖5－A），其表達(dá)量隨時(shí)間無明顯的變化。

圖1 不同鈣濃度下花鰻鱺脅迫1、4和7 d的血鈣濃度和血清滲透壓Fig.1 Serum osmolarity and Ca2＋concentration in Anguilla marmorata adapted to different Ca2＋ concentrations for 1 day，4 or 7 days注：不同時(shí)間點(diǎn)和不同鈣離子濃度的差異顯著性用不同字母表示。同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間的差異性用不同符號(hào)*（高鈣組與對(duì)照組具有顯著性差異）和#（缺鈣組與對(duì)照組具有顯著性差異）表示（P＜0.05，two-way ANOVA）Note：Significant differences between Ca2＋concentrations and different time points are identified by different letters；and different symbols*and#indicate significant differences between groups at the same time point（P＜0.05，two-way ANOVA）

圖2 不同鈣濃度下花鰻鱺脅迫1、4和7 d的各項(xiàng)血液指標(biāo)Fig.2 Hematology index in Anguilla marmorata adapted to different Ca2＋ concentrations for 1 day，4 or 7 days注：不同時(shí)間點(diǎn)和不同鈣離子濃度的差異顯著性用不同字母表示。同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間的差異性用不同符號(hào)*（高鈣組與對(duì)照組具有顯著性差異）和#（缺鈣組與對(duì)照組具有顯著性差異）表示 （P＜0.05，two-way ANOVA）Note：Significant differences between Ca2＋concentrations and different time points are identified by different letters；and different symbols*and#indicate significant differences between groups at the same time point（P＜0.05，two-way ANOVA）

3 討論

Ca2＋是自然海水的重要組成成分，對(duì)魚類的神經(jīng)元興奮性、肌肉收縮、細(xì)胞滲透性、細(xì)胞分化、激素釋放和骨組織的礦物化等生理功能均具有重要影響［19］。海水中鈣離子濃度約為10 mM，淡水中鈣離子濃度約為2 mM，洄游性魚類在洄游過程中需要面對(duì)不斷變化的鈣離子濃度［17］。因此，研究洄游性魚類體內(nèi)控制鈣離子的進(jìn)出機(jī)制及鈣離子的穩(wěn)態(tài)具有非常重要的意義。CRUZ等［20］提出在魚類鰓細(xì)胞表面的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是由上皮鈣通道調(diào)節(jié)，而這個(gè)鈣通道則由質(zhì)膜鈣ATP酶PMCA和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體 NCX組成。HOENDEROP等［15］研究表明鈣離子的流出需一個(gè)較大的電化學(xué)梯度，位于吸收細(xì)胞質(zhì)膜上的兩個(gè)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體需NCX和PMCA負(fù)責(zé)將鈣離子排出?？紤]到NCX和PMCA是主要的運(yùn)輸Ca2＋的跨膜蛋白，因此我們選擇NCX和PMCA為靶蛋白，通過極性鈣濃度脅迫來測(cè)定NCX基因3個(gè)亞型和PMCA基因2個(gè)亞型的mRNA時(shí)序表達(dá)，其次，測(cè)定了這5種基因亞型的組織表達(dá)分布，以及極性鈣濃度環(huán)境下花鰻鱺血清中的鈣濃度、滲透壓和血液生理指標(biāo)，為魚類鈣穩(wěn)態(tài)的研究提供基礎(chǔ)資料。

圖3 花鰻鱺 NCX1（A）、NCX2（B）、NCX3（C）、PMCA2（D）和 PMCA4（E）在不同組織中的表達(dá)規(guī)律Fig.3 Tissue distribution analysis of NCX1（A），NCX2（B），NCX3（C），PMCA2（D），and PMCA4（E）at the mRNA level注：不同組織相對(duì)表達(dá)的差異顯著性用不同字母表示 （P＜0.05，一維方差分析）。G：gill；L：liver；M：muscle；B：brain；Sp：spleen；Sk：skin；H：heart；Sl：swim bladder；Fi：front intestine；Mi：middle intestine；Bi：back intestine；Hk：head kidney；K：kidneyNote：Significant differences among different tissues are indicated by different letters（P ＜0.05，one-way ANOVA）.G：gill；L：liver；M：muscle；B：brain；Sp：spleen；Sk：skin；H：heart；Sl：swim bladder；Fi：front intestine；Mi：middle intestine；Bi：back intestine；Hk：head kidney；K：kidney

圖4 花鰻鱺 NCX1（A）、NCX2（B）和 NCX3（C）在鰓中不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)對(duì)不同鈣濃度的表達(dá)規(guī)律Fig.4 Expressions of NCX1（A），NCX2（B）and NCX3（C）in gill of Anguilla marmorata in response to different Ca2＋concentrations at different time points注：不同時(shí)間點(diǎn)和不同鈣離子濃度的差異顯著性用不同字母表示。同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間的差異性用不同符號(hào)*（高鈣組與對(duì)照組具有顯著性差異）和#（缺鈣組與對(duì)照組具有顯著性差異）表示 （P＜0.05，two-way ANOVA）Note：Significant differences between Ca2＋ concentrations and different time points are identified by different letters；and different symbols*and#indicate significant differences between groups at the same time point（P＜0.05，two-way ANOVA）

圖5 花鰻鱺PMCA2（A）和PMCA4（B）在鰓中不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)對(duì)不同鈣濃度的表達(dá)規(guī)律Fig.5 Expressions of PMCA2（A）and PMCA4（B）in gill of Anguilla marmorata in response to different Ca2＋concentrations at different time points注：不同時(shí)間點(diǎn)和不同鈣離子濃度的差異顯著性用不同字母表示。同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間的差異性用不同符號(hào)*（高鈣組與對(duì)照組具有顯著性差異）和#（缺鈣組與對(duì)照組具有顯著性差異）表示（P＜0.05，two-way ANOVA）Note：Significant differences between Ca2＋ concentrations and different time points are identified by different letters；and different symbols*and#indicate significant differences between groups at the same time point（P＜0.05，two-way ANOVA）

目前國內(nèi)對(duì)于魚類滲透壓的研究主要集中在鹽度脅迫，王丹等［22］研究了如花鰻鱺AQP3基因在不同鹽度下表達(dá)規(guī)律。而鈣脅迫對(duì)魚類血清滲透壓的影響報(bào)道不多。褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）低鈣條件下血清滲透壓在6 h時(shí)顯著上升，而12 h后下降至正常水平并維持穩(wěn)定［23］。在本研究中也出現(xiàn)了穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象，缺鈣環(huán)境下血清滲透壓和鈣離子濃度起初較低，但隨著時(shí)間的增加顯著地上升，在第7天3種環(huán)境下的鈣離子濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)。同樣在高鈣環(huán)境脅迫1 d后，血清滲透壓和血鈣濃度逐漸下降到穩(wěn)定狀態(tài)，此結(jié)果表明，隨著周圍環(huán)境鈣濃度的增加，花鰻鱺主動(dòng)或被動(dòng)地減少了鈣離子的吸收。CARRIER等［24］認(rèn)為，水中Ca2＋濃度的變化可增強(qiáng)鰓上皮細(xì)胞對(duì)水和離子的通透性。血細(xì)胞對(duì)魚體自身生理狀態(tài)的變化及外界環(huán)境因子刺激非常敏感，其血液指標(biāo)能反映魚類的正常生理狀態(tài)［25］。筆者測(cè)定了各項(xiàng)血液指標(biāo)（白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、葡萄糖濃度、血紅蛋白濃度和血小板數(shù)目），處理組相較對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)隨時(shí)間呈先升高后下降的趨勢(shì)，在第7天各項(xiàng)指標(biāo)呈穩(wěn)定狀態(tài)。以上結(jié)果均表明花鰻鱺體內(nèi)存在一種鈣離子調(diào)節(jié)機(jī)制以維持機(jī)體內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)。

組織表達(dá)結(jié)果顯示，花鰻鱺NCX和PMCA基因的各個(gè)亞型在腎臟中均呈現(xiàn)高表達(dá)，在腎臟中通過過濾吸收鈣離子致使腎組織表達(dá)量相對(duì)較高，這與腎臟作為動(dòng)物吸收鈣離子的主要器官相吻合［16］。另外，動(dòng)物主要通過食物來獲得鈣，其全身的鈣守恒主要通過腸的吸收和腎臟的重吸收來維持進(jìn)行［26］。本實(shí)驗(yàn)中一些鈣通道蛋白皮膚組織的表達(dá)量較高，如NCX1和NCX2，筆者推測(cè)魚類主要通過皮膚和鰓來增強(qiáng)鈣離子的吸收，由于皮膚和鰓與外界的水環(huán)境直接接觸且皮膚和鰓是離子交換的主要場(chǎng)所［26］。LIN等［27］研究顯示魚類從淡水中獲得鈣離子主要通過鰓和腸，而鰓是鈣離子吸收的主要場(chǎng)所。LAFONT等［16］通過對(duì)斑馬魚上皮鈣離子通道NCX1和PMCA2特異性表達(dá)的研究，結(jié)果顯示兩個(gè)基因在富含線粒體的鰓細(xì)胞中表達(dá)量最高。本研究中鰓組織表達(dá)量并不高，筆者推測(cè)是由于鈣離子的吸收機(jī)制發(fā)生在鰓中富含線粒體的細(xì)胞，其中鈉鈣交換體NCX與質(zhì)膜鈣離子泵PMCA參與鈣離子的吸收，它們從質(zhì)膜中排出鈣離子到血液中，故鈣離子在鰓中的濃度降低，所以鰓中的表達(dá)量并不高。綜上，本文以鰓為靶器官作為研究，探索外界鈣離子濃度變化時(shí)花鰻鱺NCX和PMCA哪些亞型的表達(dá)發(fā)生了變化，為魚類洄游中鈣穩(wěn)態(tài)的研究提供了一定的基礎(chǔ)資料。

鰓組織中鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的mRNA表達(dá)量反應(yīng)了鰓中的鈣含量。在本研究中，隨著缺鈣環(huán)境時(shí)間的延長，NCX1亞型基因mRNA表達(dá)量逐漸減弱，高鈣環(huán)境下NCX1亞型基因mRNA表達(dá)量顯著增長，而其它NCX亞型在外界鈣濃度環(huán)境改變下表達(dá)量均未發(fā)生改變。有研究報(bào)道，控制鈣離 子 的 排 出 主 要 靠 NCX1 亞 型［28］，LANGENBACHER等［11］認(rèn)為在魚腸上皮細(xì)胞NCX1是細(xì)胞膜排出鈣離子的主要蛋白，高鈣環(huán)境下可以通過質(zhì)膜鈣離子泵NCX1將Ca2＋排出。由此，筆者推測(cè)：為了維持花鰻鱺機(jī)體內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，在高鈣環(huán)境下，鰓組織中的NCX1表達(dá)量持續(xù)升高，促使鰓細(xì)胞將過多的鈣離子排出胞外；而在低鈣環(huán)境下，NCX1表達(dá)量持續(xù)降低，以減少鰓細(xì)胞中鈣離子的流失。而PMCA4亞型基因在缺鈣環(huán)境下表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，高鈣環(huán)境下表達(dá)量逐漸降低，在第7天3種鈣濃度下出現(xiàn)鈣穩(wěn)態(tài)狀態(tài)。推測(cè)低鈣環(huán)境可以誘發(fā)PMCA鈣運(yùn)輸能力的增強(qiáng)，這在虹鱒、莫桑比克羅非魚、斑馬魚、金魚 （Carassius auratus）和香魚 （Plecoglossus altivelis）中都有報(bào)道［26－30］。HOENDEROP等［15］研究表明，PMCA4在鈣離子的排出機(jī)制中具有重要作用，本研究的時(shí)序表達(dá)驗(yàn)證了PMCA4在低鈣環(huán)境下控制鈣離子的排出，高鈣環(huán)境下加快鈣離子的排出，證實(shí)了PMCA4具有鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控器的作用。而在斑馬魚中，LARONT等［16］研究發(fā)現(xiàn)上皮鈣離子通道PMCA2在鰓中MR細(xì)胞選擇性表達(dá)，并參與跨膜鈣離子吸收，本研究的結(jié)果并沒有證實(shí)PMCA2在鈣離子的調(diào)控作用，筆者推測(cè)不同物種間PMCA不同亞型扮演的功能有所不同。在小龍蝦（Procambarus clarkia）鈣離子的輸送機(jī)制研究中，WHEATLY等［31］闡述了 NCX家族基因在鈣轉(zhuǎn)運(yùn)過程扮演“馱馬”的功能，而PMCA在鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中并不扮演任何作用。

本研究顯示，在極性鈣濃度環(huán)境下，花鰻鱺鰓組織的NCX1和PMCA4在脅迫不同時(shí)段中呈現(xiàn)不同的表達(dá)變化模式，并且在各時(shí)段中，NCX1和PMCA4基因的表達(dá)水平均呈顯著的差異。進(jìn)一步說明，NCX1和PMCA4在花鰻鱺鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程中扮演了重要角色。