熱休克蛋白A12B對(duì)缺血/再灌注損傷心肌微血管內(nèi)皮完整性的保護(hù)作用

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷涉及多種機(jī)制,而內(nèi)皮細(xì)胞損傷是其中關(guān)鍵機(jī)制之一。心肌I/R損傷可破壞內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能,增加血管通透性,從而加重炎癥反應(yīng)和增加I/R后心肌無復(fù)流現(xiàn)象[1]。熱休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)已被證實(shí)高表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中,并且與血管生成相關(guān)[2]。課題組前期已闡明HSPA12B對(duì)心肌I/R損傷具有保護(hù)作用[3],但其具體機(jī)制及其對(duì)心臟血管內(nèi)皮的影響還需進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用8～10周齡雄性HSPA12B轉(zhuǎn)基因鼠(HSPA12B Transgenic,Tg)[3]為實(shí)驗(yàn)組(n=12),同窩生雄性野生型鼠(wild type,WT)為對(duì)照組(n=12)。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于南京大學(xué)動(dòng)物模式所SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 I/R模型:小鼠用1.5%～2%異氟烷吸入麻醉后,開胸,結(jié)扎心臟冠脈左前降支,45 min后解除結(jié)扎為再灌注開始[4]。所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均接受心臟I/R手術(shù)。

1.2.2 再灌注期間心肌微血管血流檢測(cè):心肌I/R開始時(shí),用25μL FITC標(biāo)記的番茄血凝素直接從靜脈注入小鼠體內(nèi)。血流重建30 min后,取心臟,每組4只,用OCT包埋制成冰凍組織塊,在心臟乳頭肌水平用切片機(jī)切成5μm橫切片,防熒光淬滅劑避光封片,熒光顯微鏡觀察復(fù)流面積。

1.2.3 伊文斯蘭滲透實(shí)驗(yàn):用來評(píng)價(jià)血管的通透性。心肌I/R開始時(shí),按照3.2μg/g小鼠體質(zhì)量從靜脈向小鼠體內(nèi)注射伊文斯蘭染料,每組5只。I/R 30 min后,用冰的1%多聚甲醛(0.05 mol/L檸檬酸緩沖液溶,pH=3.5)從左心室灌注沖洗冠狀動(dòng)脈網(wǎng),直至右心室流出的灌注液澄清;分離心臟,拍照。心室組織用甲酰胺在60 ℃條件下震蕩溶解24 h;離心、取上清讀吸光度(610 nm)定量滲漏的伊文斯蘭量。伊文斯蘭滲漏量用吸光度/g 心肌組織表示。

1.2.4 血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能的完整性:每組3只，心臟組織切成1 mm2小塊,2.5%戊二醛固定過夜,0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗,1%鋨酸固定液固定 2 h,脫水、包埋、固化,用超微切片機(jī)切成60～70 nm超薄切片,200目銅網(wǎng)搜集,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,采用透射電子顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6進(jìn)行分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組間比較采用t檢驗(yàn),P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSPA12B減少再灌注期間微血管的無復(fù)流現(xiàn)象 如圖1所示:I/R 30 min后,與WT鼠相比,Tg鼠心肌的無復(fù)流面積顯著減少[(4.2±0.9)%比(14.9±3.3)%,P<0.05]。

2.2 HSPA12B降低了I/R損傷引起的血管高通透性 I/R 30 min后,WT和Tg鼠伊文斯蘭滲漏量吸光度分別為0.52/mg心室肌組織和0.36/mg心室肌組織。與WT鼠相比,Tg鼠心臟微血管的滲透性降低了29.5%(P<0.05)。

2.3 HSPA12B保護(hù)心肌I/R損傷后的血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能的完整性 如圖2所示：I/R損傷后WT鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞收縮,細(xì)胞間裂隙形成,內(nèi)皮細(xì)胞從基底膜脫落;而這些現(xiàn)象在Tg鼠中并未觀察到。

3 討論

血管在一段時(shí)間短暫缺血后近端動(dòng)脈再次充分開放而微血管的不完全或不均勻的再灌注稱為無復(fù)流現(xiàn)象[5]。I/R后微血管的無復(fù)流現(xiàn)象是心肌I/R損傷的基本機(jī)制。早在1966年就有學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌I/R損傷后會(huì)出現(xiàn)心臟微血管無復(fù)流現(xiàn)象[7]。

圖1 I/R 30 min后WT鼠與Tg鼠心肌微血管的再灌注FITC(番茄血凝素標(biāo)記)檢測(cè)(n=4)

注:WT鼠:→內(nèi)皮細(xì)胞間裂隙形成;* 內(nèi)皮細(xì)胞損傷;Tg鼠:→內(nèi)皮細(xì)胞間連接完整;RBC:紅細(xì)胞圖2 I/R 4 h后WT鼠與Tg鼠電鏡下心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較

心肌無復(fù)流現(xiàn)象可持續(xù)4周,并可引起心室壁節(jié)段運(yùn)動(dòng)功能障礙,心室重構(gòu)和臨床預(yù)后不良[8]。因此減少無復(fù)流現(xiàn)象可改善微循環(huán)血流量,有效地保護(hù)心肌I/R損傷。本實(shí)驗(yàn)表明HSPA12B可減少心臟I/R損傷后再灌注期間的微血管無復(fù)流現(xiàn)象,說明HSPA12B可促進(jìn)I/R損傷后微血管的血流重建。

盡管心肌I/R損傷后微血管的無復(fù)流現(xiàn)象病理機(jī)制并不清楚,但是內(nèi)皮細(xì)胞損傷、微血管阻塞以及細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)水腫機(jī)械性壓迫均可導(dǎo)致I/R損傷引起的微血管無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生[5, 9-10]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)Tg鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞間裂隙形成、內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及血管的通透性都顯著減少或降低,這表明HSPA12B可通過多種途徑改善微循環(huán)血流量。

內(nèi)皮細(xì)胞完整性的破壞是心肌I/R損傷后常見的病理過程。心肌細(xì)胞內(nèi)皮完整性的破壞可導(dǎo)致血管通透性增高和嗜中性粒細(xì)胞浸潤并最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡并損害心肌功能[1,11]。 而嗜中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是嗜中性粒細(xì)胞遷移和浸潤的關(guān)鍵步驟,其黏附分子的上調(diào)對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合是至關(guān)重要的[12]。雖然本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSPA12B可降低心肌I/R損傷引起的微血管高通透性,維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性,但是嗜中性粒細(xì)胞是否參與了這個(gè)過程及其黏附分子是否上調(diào)仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。有研究報(bào)道，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活在I/R損傷中有保護(hù)作用,但HSPA12B在維持心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的保護(hù)作用機(jī)制中是否有PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的參與或其他信號(hào)通路的參與仍有待進(jìn)一步的研究。