一種霉菌和酵母菌的快速檢測(cè)研究

◎ 扶 勝，顏躍躍，周 繪，周 艷

（貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司，貴陽(yáng) 貴州 550009）

霉菌和酵母菌均屬真菌，廣泛存在于空氣、水和土壤中，種類繁多，具有很強(qiáng)的新陳代謝能力。霉菌可引起食物霉變，不僅影響食物外觀和風(fēng)味，而且攝入量過多會(huì)刺激人體消化道，導(dǎo)致腸胃不適，甚至引起疾病發(fā)生[1]。在適宜條件下，霉菌能夠產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物——霉菌毒素，造成食物中毒并有致癌作用[2]，危及生命安全。酵母菌能夠在低pH、低水活性、低濕度、高鹽或高糖的食品中生長(zhǎng)[3]，是引起這類食品腐敗變質(zhì)的主要菌株[4]，給食品工業(yè)帶來了巨大的安全隱患[5]。

目前，我國(guó)已在飲品類、堅(jiān)果類及米面制品類食品中將霉菌和酵母菌作為常見指示菌進(jìn)行檢測(cè)和控制，將其列入GB 4789.15-2010[6]系列食品安全微生物常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。關(guān)于食品中霉菌和酵母菌的檢測(cè)，現(xiàn)行的檢測(cè)技術(shù)也依賴于該標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)方法為平板法，是經(jīng)典的微生物檢測(cè)和鑒定方法，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但耗時(shí)長(zhǎng)且操作繁瑣，難以滿足快速檢測(cè)的需求。2007年，PetrifilmTM測(cè)試片被正式列入中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，試紙片法彌補(bǔ)了平板法的缺陷，逐步成為微生物檢測(cè)和鑒定的主要方法。近年來，關(guān)于霉菌和酵母菌快速檢測(cè)試紙片的研究已有報(bào)道[7-8]，但這些方法均需要涂布和蓋膜操作，引入人為操作不當(dāng)導(dǎo)致判讀結(jié)果有誤的可能。本試驗(yàn)的開展，就是為了盡可能地簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟，提高試紙片對(duì)霉菌和酵母菌的檢測(cè)效率，以獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果，為霉菌和酵母菌的快速檢測(cè)提供可靠的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、孟加拉紅、氯霉素、N,N-二甲基甲酰胺、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和氯化硝基四氮唑藍(lán)。

電熱恒溫鼓風(fēng)機(jī)、智能恒溫恒濕箱、高壓滅菌鍋、菌落計(jì)數(shù)器、精密pH計(jì)、電子分析天平、移液器、超低溫冰箱和超凈工作臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

（1）霉菌和酵母菌特征顯色液體培養(yǎng)基制備。稱取胰蛋白胨0.8～2.0 g、酵母粉0.4～0.8 g、葡萄糖1～4 g、磷酸氫二鉀0.05～0.1 g、氯化鈉0.05～0.2 g、磷酸二氫鉀0.2～0.4 g、硫酸鎂0.2～0.4 g、孟加拉紅0.04～0.1 g置于燒杯中，用蒸餾水定容至100 mL，加熱溶解后，用高壓滅菌鍋在121 ℃下滅菌15 min，冷卻至室溫后依次加入經(jīng)過過濾滅菌的1～3 mL 0.1 g/mL的氯霉素及0.015～0.040 mL酶底物混合劑，得到液體培養(yǎng)基，在0～4 ℃下冷藏備用。

（2）酶底物混合劑制備。取2 g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和1 g氯化硝基四氮唑藍(lán)，溶解于100 mL N,N-二甲基甲酰胺中。

1.2.2 測(cè)試片的制備

（1）濾紙片前處理。采用直徑為70 mm的白色中速濾紙，用1.0～1.5 mL 0.05 mol/L Triton-Tris的緩沖生理鹽水處理后，置于37 ℃恒溫箱中干燥4 h后取出，放入含有干燥劑的自封袋中，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）培養(yǎng)液吸附。取上述處理的濾紙片，121 ℃滅菌15 min后浸入培養(yǎng)基中浸泡5～10 min。取出后平放在已滅菌的超凈工作臺(tái)中，無菌條件下烘干，置于0～4 ℃的無菌冷藏箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）組裝。將上述得到的試紙片裝入無菌培養(yǎng)皿中，蓋好培養(yǎng)皿蓋，將其置于鋁箔袋中，抽真空封口，即得到快檢產(chǎn)品。

1.2.3 測(cè)試片的使用方法

（1）樣本的處理。取檢測(cè)樣本25 mL（g）放入225 mL滅菌稀釋液（磷酸鹽緩沖液或生理鹽水）中，制成1∶10的樣品勻液，吸取1∶10的樣品勻液1 mL，注入含有9 mL稀釋液的試管內(nèi)，搖勻后得到1∶100的樣品勻液，按上述方法依次稀釋。一般樣本選1～2個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)，含菌量少的液體樣本（如飲用水、礦泉水等）可直接吸取原液進(jìn)行檢測(cè)。

（2）接菌。將測(cè)試片置于已滅菌的超凈工作臺(tái)上，打開上蓋，用滅菌槍頭吸取1 mL樣品勻液加到測(cè)試片上，使液體潤(rùn)濕整張測(cè)試片，同時(shí)取1 mL稀釋液接種于另一測(cè)試片作空白對(duì)照，加蓋置于（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。每個(gè)稀釋度接種3片。

（3）結(jié)果統(tǒng)計(jì)。霉菌在測(cè)試片上呈現(xiàn)灰色、黑色和藍(lán)綠色菌落，且菌落較大呈現(xiàn)其自身的形態(tài)；酵母菌再測(cè)試片上呈現(xiàn)綠色菌落，且菌落較小、表面平滑。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

將培養(yǎng)好的酵母菌液用滅菌稀釋液稀釋至10-6、10-7兩個(gè)梯度，將霉菌稀釋至10-1、10-2備用。

1.3.1 濾紙?zhí)幚矸绞綄?duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

設(shè)計(jì)兩個(gè)處理，濾紙片經(jīng)0.05 mol/L Triton-Tris緩沖生理鹽水處理和不經(jīng)處理，其他培養(yǎng)條件一致。吸取1 mL稀釋好的菌液接種于本測(cè)試片上，以1 mL滅菌生理鹽水作為空白對(duì)照，在（28±1）℃條件下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 本測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法、3M試紙片法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

吸取1 mL稀釋好的菌液接種于本測(cè)試片、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法推薦的平板及3 M測(cè)試片上，以1 mL滅菌生理鹽水作為空白對(duì)照，在（28±1）℃條件下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 不同培養(yǎng)時(shí)間下本測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)兩個(gè)時(shí)間梯度，吸取1 mL稀釋好的菌液接種于本測(cè)試片及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法推薦的平板上，以1 mL滅菌生理鹽水作為空白對(duì)照，在（28±1）℃條件下培養(yǎng)48 h和66 h后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙?zhí)幚矸绞綄?duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

檢測(cè)霉菌的結(jié)果表明，經(jīng)過處理的濾紙與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確率達(dá)92%，濾紙未經(jīng)處理的與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確率為84%；檢測(cè)酵母菌的結(jié)果表明經(jīng)過處理的準(zhǔn)確率達(dá)103%，未經(jīng)處理的為96%，說明經(jīng)0.05 mol/L Triton-Tris緩沖生理鹽水處理后的濾紙檢測(cè)的結(jié)果更為準(zhǔn)確。生理鹽水在微生物培養(yǎng)過程中，能夠保證細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，使微生物穩(wěn)定存在，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提高。

表1 濾紙?zhí)幚矸绞綄?duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響表

2.2 本測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法、3M試紙片法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

將本實(shí)驗(yàn)所得測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法和3M試紙片法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本測(cè)試片檢測(cè)的結(jié)果與這兩種方法的準(zhǔn)確度均達(dá)到97%以上，且相較而言本測(cè)試片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異小，結(jié)果穩(wěn)定性好，見表2。

表2 本測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法、3M試紙片法的結(jié)果比較表

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間下本測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

分別用本測(cè)試片和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法培養(yǎng)樣本48 h和66 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的符合度均達(dá)到90%以上，其中培養(yǎng)霉菌的結(jié)果顯示培養(yǎng)時(shí)間為66 h的準(zhǔn)確度低于培養(yǎng)48 h，而培養(yǎng)酵母菌的結(jié)果顯示培養(yǎng)時(shí)間為66 h準(zhǔn)確度反而高于培養(yǎng)48 h的處理。說明本測(cè)試片的檢測(cè)結(jié)果可以達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表3 本測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)試結(jié)果對(duì)比表

3 討論

本實(shí)驗(yàn)得到一種可以同時(shí)用于檢測(cè)霉菌和酵母菌的快速檢測(cè)試紙片，利用微生物生化反應(yīng)的特性，將微生物胞內(nèi)酶的種類及反應(yīng)條件作為微生物分類鑒定的主要依據(jù)，通過在培養(yǎng)基中加入特異性酶顯色底物，當(dāng)目的菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，其特異性酶就能降解顯色底物，并產(chǎn)生帶有特殊顏色的代謝物，使菌落呈現(xiàn)特定的顏色或形態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)樣本中霉菌和酵母菌的檢測(cè)。且本測(cè)試片操作簡(jiǎn)便、培養(yǎng)48 h時(shí)判讀檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法97%以上，滿足實(shí)際檢測(cè)需求，具有很高的使用價(jià)值。