卡泊三醇預(yù)處理對氨基酮戊酸局部外用后裸鼠正常上皮中原卟啉IX含量的影響

嚴(yán)文杰 云健健 黃熙

541001桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚性病科（嚴(yán)文杰、黃熙）；湖北省襄陽市中醫(yī)醫(yī)院皮膚性病科（云健?。?/p>

目前局部氨基酮戊酸-光動(dòng)力療法（ALA-PDT）廣泛用于治療表皮異常增生的皮膚腫瘤。近來局部ALA-PDT被嘗試應(yīng)用于光老化等非增殖性皮膚病時(shí)也顯示出一定療效［1］。為了提高局部ALA-PDT的療效，往往采用ALA促滲劑或光敏劑增效劑促進(jìn)ALA代謝轉(zhuǎn)化為原卟啉IX（PpIX）。其中鐵螯合劑及維生素D3類似物為研究中常用的光敏劑增效劑。已有研究證實(shí)，維生素D3類似物預(yù)處理可以提高小鼠表皮腫瘤［2］及銀屑病患者［3］皮損中PpIX含量和療效，且卡泊三醇預(yù)處理裸鼠皮膚可顯著增加PpIX熒光強(qiáng)度［4-5］。本研究旨在觀察卡泊三醇預(yù)處理對ALA作用后不同時(shí)間裸鼠正常上皮組織中PpIX含量變化的影響，探討卡泊三醇能否作為局部ALA-PDT的增效劑。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

ALA散（規(guī)格118 mg，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司），PpIX［250 mg，Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司］，抗熒光衰減封片劑（5 ml，北京索萊寶科技有限公司），0.005%卡泊三醇軟膏（規(guī)格10 g，中國香港澳美制藥廠），熒光分光光度計(jì)［RF-5301pc，北京島津企業(yè)管理（中國）有限公司］，倒置熒光相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司），半微量天平（MS105DU，瑞士Mettler Toledo公司）。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康雌性4～6周齡BALB/C裸鼠（動(dòng)物合格證號(hào)45000800000014）36只，體重25～30 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在25～27℃無菌恒溫、恒濕（45%～50%）的半屏障系統(tǒng)環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前腹腔注射1%戊巴比妥（100 mg/kg）麻醉。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物分組及處理：將36只裸鼠隨機(jī)分為ALA組和卡泊三醇+ALA組，每組18只?？ú慈?ALA組裸鼠整個(gè)后背皮膚外涂卡泊三醇軟膏，每天1次，連用3 d；ALA組未做任何處理。3 d后在兩組裸鼠的后背皮膚均用亞甲蘭和聚維酮碘標(biāo)記1處1.5 cm×1.5 cm區(qū)域?yàn)閷?shí)驗(yàn)區(qū)域。將118 mg ALA溶解于0.472 ml滅菌注射用水，配制20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）ALA溶液，兩組實(shí)驗(yàn)區(qū)域均放置等面積2層紗布，將0.5 ml ALA溶液滴于紗布上，塑料薄膜封包，錫紙包扎后避光放置。外用ALA后2～7 h內(nèi)每小時(shí)各處死3只裸鼠，并迅速手術(shù)切取實(shí)驗(yàn)區(qū)域組織，等分為3份，其中1份做冰凍切片，另2份用于檢測裸鼠組織PpIX含量。

2.裸鼠組織PpIX含量檢測：①標(biāo)準(zhǔn)液配制及標(biāo)準(zhǔn)方程確定：結(jié)合張波等［6］的方法配制標(biāo)準(zhǔn)液。Matlab多項(xiàng)式擬合得出標(biāo)準(zhǔn)方程y=0.029 6X4－0.145 0X3＋0.275 1X2－0.225 3X＋0.068 8，其中X為PpIX熒光強(qiáng)度對數(shù)值，y為抽提液PpIX濃度（mg/L），擬合度0.998 9，曲線擬合成立；組織PpIX含量（Yt）=y×抽提液體積/組織質(zhì)量（ng/g組織）；②樣品組織PpIX含量檢測：取2份相似組織稱重后分別放入不同的陶瓷研缽內(nèi)，加入適量液氮研磨成粉，加入Hepes緩沖液混勻后，移入離心試管中，加入5 ml乙酸乙酯與冰醋酸（4∶1）混合液混勻，134×g離心1 min，取上清液，并加入4 ml 0.5%（體積分?jǐn)?shù)）鹽酸，劇烈振搖、混勻，134×g離心1 min，靜置，待充分分層后，取下層液體用熒光分光光度計(jì)檢測，根據(jù)上述公式計(jì)算PpIX含量。

3.裸鼠組織內(nèi)PpIX分布觀察：取1份組織的冰凍切片，抗熒光衰減封片劑封片后，倒置熒光相差顯微鏡下觀察PpIX分布，選擇黃色激發(fā)區(qū)（BP545-580、DM600、BA610-1F），明視場對應(yīng)3號(hào)濾光片，曝光指數(shù)400，觀察100倍放大圖像，并拍照記錄。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、裸鼠皮膚組織PpIX含量

在外用ALA后5～6 h之前PpIX含量均隨時(shí)間延長逐漸增多，ALA組在第5小時(shí)達(dá)高峰，卡泊三醇+ALA組在第6小時(shí)達(dá)到峰值，見圖1。單因素方差分析顯示，兩組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)PpIX含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ALA組F=55.76，P＜0.01；卡泊三醇 +ALA組F=145.61，P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示，ALA組PpIX含量與時(shí)間無顯著相關(guān)性（r=0.451，P=0.37），但卡泊三醇+ALA組PpIX含量與時(shí)間呈強(qiáng)相關(guān)（r=0.913，P=0.01）。在外用ALA后2～7 h時(shí)兩組間PpIX含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t值依次為2.311、2.764、3.028、3.241、12.978、13.235，P＜ 0.05或0.01。

二、PpIX在裸鼠組織內(nèi)的分布

正常裸鼠表皮層有微弱的熒光，見圖2。ALA組和卡泊三醇+ALA組表皮和真皮組織均可觀察到彌漫性PpIX熒光分布，表皮熒光強(qiáng)度強(qiáng)于真皮層，且細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)于細(xì)胞間，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，在2～4 h內(nèi)兩組間熒光強(qiáng)度無明顯差異，在5～7 h尤其是6 h時(shí)卡泊三醇+ALA組熒光強(qiáng)度明顯高于ALA組，見圖3。

圖1 氨基酮戊酸（ALA）組和卡泊三醇+ALA組裸鼠皮膚原卟啉IX（PpIX）含量比較

圖2 正常裸鼠皮膚組織明視場圖像（×100）

討 論

ALA是親水性的光敏劑前體，能滲入角質(zhì)層并進(jìn)入正常組織和增生活躍的靶組織，細(xì)胞內(nèi)的酶促反應(yīng)再將ALA轉(zhuǎn)換為PpIX，PpIX是一種內(nèi)源性光敏劑，當(dāng)暴露于它的作用光譜后，可產(chǎn)生活性氧進(jìn)而破壞靶細(xì)胞。盡管有研究報(bào)道［7］，ALA可以滲入小鼠正常皮膚的表皮、真皮層及真皮中的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞并轉(zhuǎn)化為PpIX，但ALA的非親脂性及皮膚角質(zhì)層的屏障作用限制了其在皮膚中的滲透，限制了局部ALA-PDT的療效。有兩大類預(yù)處理方案可以提高局部ALA-PDT療效，一是物理或化學(xué)方法如刮除術(shù)、微針、二甲基亞砜等，二是ALA增效劑如鐵螯合劑、維生素D3類似物等?？ú慈?、骨化三醇均屬于維生素D3類似物，是治療尋常性銀屑病的常規(guī)外用藥物，其安全性及耐受性良好。Sato等［8］報(bào)道，維生素D3類似物預(yù)先處理體外培養(yǎng)的大鼠角質(zhì)形成細(xì)胞后使用ALA，不僅可以提高細(xì)胞內(nèi)PpIX濃度，且增加其光敏感性。此后不斷有研究證實(shí)，維生素D3類似物預(yù)處理可提高ALA-PDT在小鼠鱗狀細(xì)胞癌（A431）［2］、乳腺癌［9］及口腔癌［10］模型中的PpIX含量和療效。維生素D3類似物作為光敏劑增效劑的作用機(jī)制主要是通過增加糞卟啉原氧化酶和（或）減少亞鐵原卟啉合成酶的表達(dá)使PpIX在細(xì)胞內(nèi)累積增加。

圖3 不同時(shí)間裸鼠皮膚組織內(nèi)原卟啉IX熒光分布（×100）

為了解PpIX在組織中的分布及隨時(shí)間變化情況，我們在外用ALA后第2～7小時(shí)每小時(shí)切取裸鼠皮膚組織。由于石蠟切片自發(fā)熒光強(qiáng)，而且在脫蠟處理中會(huì)造成PpIX丟失與熒光淬滅，所以我們制作冰凍切片后在倒置相差顯微鏡下觀察PpIX熒光分布。本研究結(jié)果顯示，在局部外用ALA 5 h后，ALA組裸鼠皮膚組織PpIX濃度最高。李晶晶等［11］發(fā)現(xiàn)，PpIX熒光強(qiáng)度在小鼠正常皮膚上隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)并在5 h時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸減弱。本研究中裸鼠上皮PpIX的濃度變化曲線與李晶晶等［11］研究結(jié)果基本一致，說明體內(nèi)監(jiān)測得到的熒光強(qiáng)度曲線在一定程度上可以反映體內(nèi)組織中PpIX含量的變化趨勢。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道［12］人體正常皮膚局部使用ALA后PpIX熒光強(qiáng)度在6 h時(shí)達(dá)峰值，但曲線變化趨勢與本研究結(jié)果基本一致。本研究中卡泊三醇+ALA組PpIX濃度的最大值是ALA組的近1.5倍，在相同時(shí)間點(diǎn)6 h處，卡泊三醇+ALA組PpIX含量是ALA組的2.0倍，提示卡泊三醇可以提高正常上皮內(nèi)PpIX含量，其機(jī)制可能是改變血紅素合成途徑中酶的活性和（或）誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分化和表皮增殖等［4］。我們進(jìn)一步分析顯示，卡泊三醇+ALA組7 h內(nèi)PpIX含量與時(shí)間變化呈正相關(guān)，而ALA組不存在這種相關(guān)性，進(jìn)一步說明卡泊三醇可改變ALA吸收過程，隨時(shí)間延長促進(jìn)PpIX含量增加。但本實(shí)驗(yàn)中從第2小時(shí)開始監(jiān)測PpIX含量，如細(xì)化監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)，在早期（2 h內(nèi)）卡泊三醇+ALA組PpIX含量是否與時(shí)間相關(guān)還需進(jìn)一步研究。

在特定波長光源照射下裸鼠組織內(nèi)PpIX被激發(fā)出肉眼可見的磚紅色熒光，皮膚表面的熒光強(qiáng)度可以反映局部組織內(nèi)光敏劑PpIX濃度。大部分研究往往使用表面熒光檢測儀通過測定皮膚表面的熒光強(qiáng)度來評(píng)估組織內(nèi)PpIX含量，但不能直接觀察到組織內(nèi)部PpIX的空間分布情況。本研究結(jié)果顯示，兩組小鼠上皮組織的表皮及真皮層在熒光顯微鏡下均發(fā)出磚紅色熒光，表明表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞中均累積了大量PpIX，與De Bruijn等［13］通過分析熒光光譜得出的結(jié)論類似。本研究中通過肉眼可以直觀地發(fā)現(xiàn)兩組熒光強(qiáng)弱變化，與PpIX含量動(dòng)力學(xué)變化趨勢基本一致，而且6 h處卡泊三醇+ALA組熒光強(qiáng)度達(dá)到高峰，明顯高于ALA組，表明卡泊三醇在此時(shí)明顯提高了PpIX含量，而ALA組在5 h處熒光強(qiáng)度達(dá)到高峰后逐步衰減，表明卡泊三醇+ALA組比ALA組PpIX蓄積時(shí)間更長、蓄積量更大。PpIX熒光在表皮層較真皮層強(qiáng)，紅色熒光主要分布于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞間相對較弱，這與ALA在組織細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑相關(guān)。ALA進(jìn)入上皮細(xì)胞及靶組織后會(huì)在線粒體中轉(zhuǎn)化為PpIX，然后光敏劑PpIX從線粒體滲透到其他的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)中。本研究中卡泊三醇+ALA組PpIX的熒光遍及表皮層與真皮層，如何更好地控制PpIX在皮膚各層的蓄積量，尚待進(jìn)一步研究。