滌綸經(jīng)編小口徑人工血管的制備工序?qū)ζ渖锵嗳菪缘挠绊?

1.東華大學(xué)紡織學(xué)院，上海 201620；2.東華大學(xué)紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620

滌綸大口徑紡織基人工血管已作為替代物，廣泛應(yīng)用于血管外科。但滌綸小口徑人工血管作為移植替代物應(yīng)用于人體時(shí)，往往會(huì)因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞在材料表面內(nèi)皮化的速度緩慢，從而引起內(nèi)膜異常增生或形成血栓，導(dǎo)致血管移植后出現(xiàn)再狹窄、遠(yuǎn)期通暢率低等問題[1-4]。而解決這些問題的關(guān)鍵是提高內(nèi)皮細(xì)胞在材料表面內(nèi)皮化的速度。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，生物材料表面的微觀結(jié)構(gòu)對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的黏附有很大的影響。就膜材料而言，材料表面的微觀結(jié)構(gòu)主要指表面粗糙度、孔隙率和孔徑尺寸等，而納米纖維膜材料中納米纖維的直徑也會(huì)對(duì)材料表面的微觀結(jié)構(gòu)造成影響。已有的針對(duì)細(xì)胞黏附的研究表明，人類和其他哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞更容易在孔徑為20～125 μm的材料表面黏附和增殖，因此，通過選用微米級(jí)紗線、設(shè)計(jì)合理的組織結(jié)構(gòu)、采用機(jī)織或針織工藝，可以構(gòu)造出適合內(nèi)皮細(xì)胞黏附的孔徑尺寸。此外，相對(duì)于納米纖維膜材料，機(jī)織或針織材料均具備一次成形且力學(xué)性能優(yōu)秀等特點(diǎn)[5-8]。

本研究為確保人工血管既具備良好的順應(yīng)性又能滿足人體對(duì)其力學(xué)性能的要求，利用生物級(jí)滌綸復(fù)絲制備管狀經(jīng)編織物(即管坯)，然后依次對(duì)其進(jìn)行洗滌處理、緊密化處理、預(yù)波紋化處理和波紋化處理，以期提高其對(duì)細(xì)胞的相容性，并選取各道工序后的材料進(jìn)行體外細(xì)胞試驗(yàn)，探索滌綸小口徑人工血管的制備過程中，材料表面的微觀結(jié)構(gòu)的變化是否會(huì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附造成影響。利用細(xì)胞增殖及細(xì)胞黏附試驗(yàn)，系統(tǒng)評(píng)價(jià)整個(gè)制備過程中材料表面的結(jié)構(gòu)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞在其表面黏附的影響，以期獲得材料的生物相容性，為后續(xù)臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 滌綸經(jīng)編小口徑人工血管的制備

選取生物級(jí)滌綸復(fù)絲為原料，采用針織經(jīng)編工藝，通過調(diào)節(jié)雙針床織機(jī)前后梳櫛的運(yùn)動(dòng)織造管狀經(jīng)編織物(即管坯)；然后對(duì)管坯依次進(jìn)行洗滌處理、緊密化處理、預(yù)波紋化處理和波紋化處理，最終制得滌綸經(jīng)編小口徑人工血管(圖1)。表1歸納了各工序所得管狀經(jīng)編織物中的線圈長(zhǎng)度及管徑。將各工序所得的管狀經(jīng)編織物分別沿軸向剪開并裁剪出直徑為1.3 cm的圓形，得到試樣A～試樣E共5塊試樣，用去離子水洗凈，再采用高壓蒸汽滅菌法滅菌后烘干備用。

(a) 管坯成形

(b) 洗滌處理后

(c) 緊密化處理后

(d) 預(yù)波紋化處理后

(e) 波紋化處理后

表1 各工序所得管狀經(jīng)編織物的線圈長(zhǎng)度及管徑

2 性能測(cè)試

2.1 紅外光譜掃描

利用Nicolet 6700紅外光譜儀對(duì)各工序所得管狀經(jīng)編織物試樣進(jìn)行全反射紅外光譜測(cè)試，測(cè)試波數(shù)范圍為600～4 000 cm-1。利用所得紅外光譜圖，比較分析各工序是否對(duì)試樣表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)造成影響。

2.2 試驗(yàn)細(xì)胞的選擇與準(zhǔn)備

選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC001，澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。將凍存于液氮罐中的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇后，在37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中經(jīng)過3次傳代培養(yǎng)后，方可進(jìn)行細(xì)胞的種植。

2.3 細(xì)胞種植

將各道工序得到的試樣按照24、96、168 h的培養(yǎng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，擺放在3塊24孔板內(nèi)，每天每塊試樣設(shè)置3塊平行樣進(jìn)行試驗(yàn)。將培養(yǎng)好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞稀釋并計(jì)數(shù)，按照每孔20 000個(gè)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞濃度種植到試樣上，并設(shè)置空白對(duì)照樣。將細(xì)胞培養(yǎng)板放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中，于37 ℃的條件下培養(yǎng)。

2.4 細(xì)胞增殖

在將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)20、92、164 h后，向24孔板的每個(gè)孔內(nèi)添加40 μL細(xì)胞活性檢測(cè)試劑(CCK-8試劑盒，凱基生物技術(shù)有限公司)繼續(xù)培養(yǎng)，每塊試樣均設(shè)置3塊平行樣用于對(duì)照。再經(jīng)過4 h的培養(yǎng)后，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)試吸光度。

2.5 細(xì)胞黏附

將與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)24、96、168 h的24孔板中的培養(yǎng)基吸出。由于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，故不會(huì)被吸出，利用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值為7.4)清洗24孔板中的試樣與細(xì)胞3次，然后使用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定細(xì)胞與試樣2 h；隨后，將固定好的試樣與細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精中依次浸泡脫水，每種酒精中均浸泡5 min；最后，將脫水后的試樣在冷凍干燥機(jī)中干燥，使用EVO LS 15掃描電鏡(德國卡爾蔡司公司)觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在試樣表面的生長(zhǎng)狀態(tài)。

3 結(jié)果與討論

表1的測(cè)試結(jié)果表明，在滌綸經(jīng)編小口徑人工血管的制備過程中：管坯成形、洗滌處理、緊密化處理后，纖維間距會(huì)逐漸減小，其中緊密化處理后線圈長(zhǎng)度明顯減小，前梳和后梳的線圈長(zhǎng)度分別減小了22.5%和15.7%，這使得緊密化處理后的管徑相比于管坯成形和洗滌處理后的明顯減小(圖1)，故而大大縮小了組織點(diǎn)間距，試樣表面趨于平整；預(yù)波紋化處理后，線圈結(jié)構(gòu)及紗線和單纖維的細(xì)度不均勻性改變較小，這表明此時(shí)結(jié)構(gòu)已趨于穩(wěn)定；波紋化處理后，前梳和后梳的線圈長(zhǎng)度均有所增加。5道工序處理后，試樣的表面微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，且已有研究表明，試樣表面結(jié)構(gòu)的參數(shù)會(huì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的響應(yīng)產(chǎn)生較大的影響[9-10]。因此，本試驗(yàn)針對(duì)試樣表面結(jié)構(gòu)的變化，探究了整個(gè)制備過程中試樣表面結(jié)構(gòu)對(duì)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響。

3.1 紅外光譜測(cè)試

分析圖2的紅外光譜可知，在經(jīng)過管坯成形、洗滌處理、緊密化處理、預(yù)波紋化處理和波紋化處理后，滌淪經(jīng)編小口徑人工血管并沒有出現(xiàn)新的特征峰，這表明后期的工序處理沒有在試樣表面引入新的官能團(tuán)，未造成試樣表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。因此可以認(rèn)為，整個(gè)制備過程只改變了試樣表面的物理結(jié)構(gòu)，即試樣表面的微觀結(jié)構(gòu)。

圖2 各道工序處理后試樣的紅外測(cè)試光譜圖

3.2 細(xì)胞增殖

圖3的細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的增加，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在試樣A～試樣E表面的增殖速度隨試樣線圈長(zhǎng)度的減小而提高。且由于吸光度的高低可直接反映出人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在試樣表面的活性及增殖情況[11-12]，故基于試樣A～試樣E在細(xì)胞培養(yǎng)168 h后的吸光度可以認(rèn)為，5塊試樣可根據(jù)細(xì)胞活性分為3組，試樣A(第一組)，試樣B和試樣C(第二組)，試樣D和試樣E(第三組)，且試樣表面細(xì)胞活性大小的順次為第三組>第二組>第一組。

1.3.2 雜交緩沖液 雜交緩沖液Ⅰ：溶解有10% 硫酸葡聚糖的 4×檸檬酸鈉緩沖液，專用于miR-21 和陰性探針；雜交緩沖液Ⅱ：含 50% 去離子甲酰胺、10% 硫酸葡聚糖、80 mmol/L TE、0.6 mol/LNaCl 的 Denhardt 液，專用于 miR-34a探針。

比較圖3中的增殖數(shù)據(jù)(吸光度)可以看出，培養(yǎng)168 h后，試樣A和試樣B之間的細(xì)胞活性有顯著性差異，試樣C和試樣D之間的細(xì)胞活性也有顯著性差異，這表明洗滌處理和預(yù)波紋化處理對(duì)滌綸經(jīng)編小口徑人工血管的細(xì)胞相容性的提升有顯著影響，原因在于：

(1) 試樣A培養(yǎng)24、96、168 h后吸光度沒有差異(p>0.05)，這表明細(xì)胞在試樣A表面不能很好地黏附和增殖。其中，培養(yǎng)24 h后較低的吸光度(低于培養(yǎng)24 h后空白對(duì)照組吸光度值的70%)表明，剛剛成形的管坯具有一定的細(xì)胞毒性。而經(jīng)過洗滌處理后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在試樣B表面的增殖有明顯的提高，這表明洗滌處理可以除去織造過程中殘留在管坯表面微小的污漬、油漬等雜質(zhì)，以確保滌綸經(jīng)編小口徑人工血管無細(xì)胞毒性。

(2) 相比于試樣C，細(xì)胞在試樣D表面的增殖有了顯著提高。盡管緊密化處理后試樣C的線圈長(zhǎng)度顯著減小，但細(xì)胞增殖量沒有顯著提高；而預(yù)波紋化處理后試樣D的線圈長(zhǎng)度沒有明顯改變，但細(xì)胞增殖量卻顯著提高。這表明，預(yù)波紋化處理后的試樣表面出現(xiàn)的波紋結(jié)構(gòu)更適合內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及增殖。

圖3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在試樣表面培養(yǎng)24、96和168 h后的增殖情況(其中，*表示p<0.05，Δ表示p>0.05)

3.3 表面形貌

通過EVO LS 15掃描電鏡觀察滌綸經(jīng)編小口徑人工血管制備過程中表面結(jié)構(gòu)的變化如圖4所示，可以看出：

(1) 管坯成形階段，試樣A表面纖維排列平行度和取向度都較低，紗線蓬松，纖維間距離較大且表面含有雜質(zhì)顆粒。

(2) 洗滌處理后，試樣B表面雜質(zhì)被清洗，纖維表面變光滑，同時(shí)纖維間距離減小且排列趨于整齊，但總體相較于試樣A表面形貌沒有發(fā)生明顯的變化。

(4) 預(yù)波紋化處理后，試樣D的線圈長(zhǎng)度有少量的伸長(zhǎng)(前梳3%，后梳6%)，但由于有波紋的存在，纖維之間受到擠壓，纖維間距更加縮小、排列更加整齊。

(5) 波紋化處理后，試樣E的表面結(jié)構(gòu)已趨于平整，纖維排列整齊且取向度高，這有利于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的取向黏附與增殖。

圖4 滌綸經(jīng)編小口徑人工血管制備過程中的表面形貌

3.4 細(xì)胞黏附

通過EVO LS 15掃描電鏡觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)168 h后在試樣表面的生長(zhǎng)狀態(tài)(圖5)，可以看出：

(1) 試樣A表面粗糙，纖維間距離較大(大于20 μm)，故很少有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附于纖維之間，且黏附的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是以單個(gè)的形式附著于單根纖維上的。同時(shí)，機(jī)油等可能存在的加工雜質(zhì)會(huì)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理活動(dòng)產(chǎn)生一定的影響，因此較難在試樣表面尋找到黏附的細(xì)胞。

(2) 洗滌處理時(shí)，水流在超聲波的震動(dòng)作用下使纖維的排列由無序向有序過渡。所得試樣B相對(duì)于試樣A，纖維排列更整齊、間距更緊密，因此，細(xì)胞外基質(zhì)可憑借其表面張力附著于纖維之間。但由于纖維間距仍然偏大，附著于相鄰纖維上的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞之間無法建立相互聯(lián)系，再加上試樣結(jié)構(gòu)蓬松、滌綸表面為疏水性，單個(gè)黏附于纖維上的細(xì)胞無法和纖維緊密結(jié)合，故很難在試樣表面形成內(nèi)皮層。

(3) 試樣C經(jīng)過緊密化處理，紗線交織點(diǎn)間的纖維排列已相對(duì)緊密，因此可看到有較多的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附并將部分纖維覆蓋，但由于紗線交織點(diǎn)旁的纖維仍然雜亂，因此依然不能使相鄰的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞連成一片即不能很好地內(nèi)皮化。試樣C相比于試樣B，試樣C的生物相容性略有提高，但提高并不明顯。

(4) 相比于試樣C，預(yù)波紋化處理的試樣D的表面有明顯的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，且相鄰纖維上黏附的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞之間建立了聯(lián)系，并開始沿纖維方向在纖維表面增殖，這是內(nèi)皮化的開始。同時(shí)，在紗線交織點(diǎn)之間可以明顯看到細(xì)胞外基質(zhì)黏附于纖維之間，表明紗線交織點(diǎn)處纖維間間距與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞尺寸相當(dāng)，這有利于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞橫跨生長(zhǎng)，并為快速內(nèi)皮化提供了很好的結(jié)構(gòu)保障。

(5) 相較于試樣D，試樣E在經(jīng)過波紋化處理后表面更加平整，但內(nèi)皮化進(jìn)程并沒有明顯加快，這說明波紋化處理對(duì)于提高管狀經(jīng)編織物的生物相容性貢獻(xiàn)并不大。

結(jié)合細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在滌綸經(jīng)編小口徑人工血管的制備過程中，洗滌和預(yù)波紋化處理對(duì)細(xì)胞相容性有很大的提升。其中，洗滌處理消除了管坯表面因殘留物所造成的細(xì)胞毒性，但不能消除表面結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞黏附的影響，其對(duì)內(nèi)皮化進(jìn)程無推動(dòng)作用。相比之下，預(yù)波紋化處理使得滌綸經(jīng)編小口徑人工血管的結(jié)構(gòu)參數(shù)更加合理，表面更加平整，且纖維排列更加緊密，纖維平行順直度和取向度明顯提高。

本試驗(yàn)選取的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的直徑約為20 μm，單根滌綸的直徑約為10 μm。波紋化處理后，滌綸經(jīng)編小口徑人工血管材料表面纖維平行排列且緊密，紗線交織處的高度小于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的直徑，因此聚集在交織處的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可以沿垂直于纖維和平行于纖維的兩個(gè)方向增殖爬行[圖5(E)]，并使得黏附于交織處纖維表面的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞之間很容易地建立聯(lián)系，促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及內(nèi)皮化進(jìn)程，從而在結(jié)構(gòu)參數(shù)方面對(duì)提高滌綸經(jīng)編小口徑人工血管的細(xì)胞相容性做出貢獻(xiàn)。

圖5 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在試樣表面生長(zhǎng)168 h后的黏附狀態(tài)(試樣A中綠色箭頭所指及纖維上的白點(diǎn)為試樣表面附著的雜質(zhì)，試樣B～試樣E中綠色箭頭所指為黏附在試樣表面的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)

4 結(jié)論

縱觀滌綸經(jīng)編小口徑人工血管的制造過程發(fā)現(xiàn)，5道工序處理后試樣表面的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，這對(duì)試樣的細(xì)胞相容性有著十分顯著的影響，其中預(yù)波紋化處理對(duì)細(xì)胞黏附的影響最大。洗滌處理雖然可以除去試樣表面的雜質(zhì)，消除試樣的細(xì)胞毒性，但不能改善試樣的表面結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖；但預(yù)波紋化處理可使試樣表面的結(jié)構(gòu)更加平整、纖維排列平行并緊貼、紗線交織點(diǎn)間距進(jìn)一步縮小，這有利于相鄰人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互聯(lián)系，促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在試樣表面的黏附與增殖，進(jìn)而推動(dòng)內(nèi)皮化的進(jìn)程?？傊来谓?jīng)過管坯成型、洗滌處理、緊密化處理、預(yù)波紋化處理和波紋化處理后，滌綸經(jīng)編小口徑人工血管細(xì)胞相容性已經(jīng)滿足要求，且預(yù)計(jì)能在體外短時(shí)間內(nèi)皮化，以適應(yīng)體內(nèi)病變部位的需求。