軸向多光阱微粒捕獲與實(shí)時(shí)直接觀測技術(shù)?

王玥 梁言生 嚴(yán)紹輝 曹志良 蔡亞楠 張艷 姚保利 雷銘

1)(中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所,瞬態(tài)光學(xué)與光子技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710119)

2)(中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

傳統(tǒng)的光鑷技術(shù)使用單個(gè)物鏡同時(shí)進(jìn)行光學(xué)捕獲與顯微成像,使得捕獲與成像區(qū)域被限制在物鏡焦平面附近,無法同時(shí)觀察到沿光軸方向(即Z向)捕獲的多個(gè)微粒.本文提出一種軸平面(X Z平面)Gerchberg-Saxton迭代算法來產(chǎn)生沿軸向分布的多光阱陣列,將軸平面成像技術(shù)與光鑷結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了沿軸向?qū)Χ趸栉⑶虻亩喙廒逋瑫r(shí)捕獲與實(shí)時(shí)觀測.通過視頻分析法測量了多個(gè)二氧化硅微球在軸向光鑷陣列中的布朗運(yùn)動,并標(biāo)定了光阱剛度.本文提出的軸向多光阱微粒捕獲與實(shí)時(shí)觀測技術(shù)為光學(xué)微操縱提供了一個(gè)新的觀測視角和操縱方法,為生物醫(yī)學(xué)、物理學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究提供了一種新的技術(shù)手段.

1 引 言

自1986年Ashkin等[1]發(fā)現(xiàn)光場梯度力可捕獲微小電介質(zhì)粒子進(jìn)而提出光鑷概念以來,光鑷技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)[2?5]和物理學(xué)[6?9]等研究領(lǐng)域.例如,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,它可以用來研究活體細(xì)胞和生物大分子的個(gè)體行為;在原子物理研究中,它可以用來捕獲和冷卻原子,研究玻色-愛因斯坦凝聚.利用衍射光學(xué)元件調(diào)制入射光的波前可以產(chǎn)生三維光阱陣列,同時(shí)對多個(gè)微粒進(jìn)行復(fù)雜的三維空間微操縱[10].

微粒的三維空間動態(tài)微操縱使光鑷技術(shù)在實(shí)際研究中具有極高的應(yīng)用價(jià)值.但傳統(tǒng)的光鑷技術(shù)使用單個(gè)物鏡同時(shí)進(jìn)行光學(xué)捕獲與顯微成像,使得捕獲與成像區(qū)域被限制在物鏡焦平面附近,無法同時(shí)觀察到沿軸向捕獲和排列的多個(gè)微粒,限制了光鑷捕獲的應(yīng)用.三維成像技術(shù)是可能的解決方法.以激光共聚焦技術(shù)為代表的點(diǎn)掃描顯微成像技術(shù)利用高度聚焦的激光束對樣品進(jìn)行逐點(diǎn)掃描,激發(fā)出的熒光信號經(jīng)過探測孔濾波后被光電倍增管探測收集,最后將所有信號重新組合生成一個(gè)三維圖像.這種方法成像速率較低,不滿足光鑷快速成像的需要[11].以結(jié)構(gòu)光照明顯微[12]、光片顯微[13]為代表的寬場成像技術(shù)可以快速獲取樣品的三維信息,但需沿光軸(Z)方向逐層拍攝樣品的多個(gè)橫平面(XY平面)二維圖像,再提取軸平面(XZ平面)的信息,仍不滿足光學(xué)捕獲的實(shí)時(shí)成像要求.2007年,牛津大學(xué)的Wilson等[14,15]提出了一種可以實(shí)現(xiàn)快速三維成像的遠(yuǎn)距離聚焦顯微成像技術(shù).該技術(shù)使用一對完全相同的顯微物鏡,利用兩個(gè)物鏡補(bǔ)償?shù)谝粋€(gè)物鏡引入的球差,因而可以在第二個(gè)物鏡的焦區(qū)得到樣品的完美實(shí)像,再使用一個(gè)平面鏡對這個(gè)三維實(shí)像進(jìn)行高速推掃便可以獲得樣品的三維實(shí)像.這種成像方法不需要移動樣品,平移臺的掃描速率可以達(dá)到千赫茲,成像速度大大提升.同時(shí),遠(yuǎn)距離聚焦技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)快速軸平面成像和任意平面成像[16,17].2014年,牛津大學(xué)的Curran等[18]與Wilson團(tuán)隊(duì)合作,將遠(yuǎn)距離聚焦顯微成像技術(shù)應(yīng)用在全息光鑷技術(shù)中,實(shí)現(xiàn)了多個(gè)微粒的三維捕獲與實(shí)時(shí)成像.但集成后的成像系統(tǒng)需要三個(gè)高數(shù)值孔徑物鏡才可以實(shí)現(xiàn)三維成像,導(dǎo)致整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的透過率不高.另外高數(shù)值孔徑物鏡的視場很小,軸向的觀測距離十分有限.

本文提出了一種直接觀測軸平面的方法,并將此與全息光鑷技術(shù)相結(jié)合,可以直接觀察軸平面上微粒的操縱過程.為實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的軸向多光阱捕獲,本文提出了基于軸平面傅里葉變換的Gerchberg-Saxton(GS)迭代算法.與透鏡光柵組合法等直接算法相比較,此算法具有更高的調(diào)制效率,所產(chǎn)生的沿軸向分布的多光阱陣列具有更銳利的強(qiáng)度分布.理論上,利用軸平面GS算法產(chǎn)生的點(diǎn)光阱具有理想的高斯強(qiáng)度分布;實(shí)驗(yàn)上,實(shí)現(xiàn)了對多個(gè)二氧化硅微球的軸向同時(shí)捕獲與光阱剛度的標(biāo)定.

2 軸平面多光阱產(chǎn)生的基本原理

全息光鑷技術(shù)的核心是通過衍射光學(xué)元件來調(diào)制入射光的相位分布,使調(diào)制后的光場經(jīng)物鏡的傅里葉變換作用后在物鏡的后焦面上形成所需的目標(biāo)光場分布[19,20].隨著光鑷技術(shù)的發(fā)展,全息光鑷技術(shù)不僅要求在物鏡后焦面上產(chǎn)生光阱,而且要求光阱具有三維空間分布,特別是軸平面技術(shù)的發(fā)展要求可以實(shí)現(xiàn)在任一軸平面上產(chǎn)生所需要的光阱陣列.如圖1所示,本文中所提到的Z方向?yàn)楣廨S方向;與光軸方向垂直的平面為XY平面,本文中稱為橫平面;與光軸方向平行的平面為XZ平面,本文中稱為軸平面.

三維光阱陣列的產(chǎn)生可以采用光柵透鏡疊加的方法[21,22],通過光柵相位因子可以控制光阱的橫向移動,菲涅耳透鏡相位因子可以控制光阱的軸向移動.該算法簡單快速,但再現(xiàn)質(zhì)量隨光阱復(fù)雜程度的增加而急速下降.另一種常用方法是迭代算法[23,24],例如傳統(tǒng)的三維GS算法.這種方法需要將三維目標(biāo)場分割成多個(gè)橫平面,然后通過GS算法分別計(jì)算每一平面光場的相位全息圖,最后將所有全息圖疊加合成,因此計(jì)算量巨大[25].為快速高效地產(chǎn)生特定的軸平面光場分布,本文提出一種直接調(diào)控軸平面光場強(qiáng)度分布的GS迭代算法,即軸平面GS算法.此算法具有很高的調(diào)制效率,所產(chǎn)生的多光阱陣列具有比直接算法更銳利的強(qiáng)度分布.同時(shí),該算法的計(jì)算量要比三維GS算法的計(jì)算量小得多.

圖1 捕獲區(qū)域的空間坐標(biāo)系示意圖Fig.1.Schematic diagram of space coordinate system in trapping volum e.

軸平面GS算法是基于軸平面傅里葉變換公式的迭代算法,下面給出簡單的推導(dǎo)過程.用ψH(kx,ky)和ψT(x,y,z)分別表示調(diào)制光場和目標(biāo)光場,其中(kx,ky)和(x,y,z)分別表示SLM平面和焦區(qū)的坐標(biāo).根據(jù)理查德沃爾夫衍射理論[26],焦場可以寫為

這里C是常數(shù),(kx,ky)=k(u/fv/f)是橫向波數(shù),k和f表示波數(shù)和焦距,z=0表示焦平面.縱向波數(shù)與橫向波數(shù)滿足關(guān)系積分區(qū)域?yàn)槠渲蠥表示捕獲物鏡的數(shù)值孔徑.

下面對(1)式中的積分進(jìn)行轉(zhuǎn)換,使其更適合于軸平面快速傅里葉變換(axial-plane Fourier transform,FT),即通過dkxdky=(k/|ky|)dkxdkz將積分變量改為kx和kz,令y=0,(1)式中的積分變?yōu)?/p>

橫向波數(shù)ky滿足為積分區(qū)域.變換后的軸平面上的光場ψT(xz)被表達(dá)為變量kx和kz的角譜積分,可以通過FT來計(jì)算.但(2)式中的角譜函數(shù)是ψH(kx,ky)和ψH(kx,?ky)之和,即ψH分別在ky>0和ky<0區(qū)域的值,而(2)式中積分項(xiàng)的傅里葉逆變換不足以明確定義所以為了明確定義,我們假設(shè)ψH關(guān)于ky對稱,即,角譜函數(shù)ψH(kx,ky)和加載到空間光調(diào)制器上的調(diào)制光場可以就此確定,從而得到軸平面上的焦場ψT(x,0,z).

基于(2)式中的積分變換,通過調(diào)制輸入光場ψH(kx,ky)便可以產(chǎn)生設(shè)定的軸平面焦場ψT(x,0,z).將該變換應(yīng)用到經(jīng)典的GS算法中,便可以快速、高效地在軸平面上直接產(chǎn)生任意光場.

為了驗(yàn)證軸平面GS算法的有效性,我們對比了這種算法與基于菲涅耳透鏡的直接算法的理論光場結(jié)果,如圖2所示,所用聚焦透鏡的數(shù)值孔徑為0.95.圖2(a)給出了基于菲涅耳透鏡組合的直接算法的結(jié)果,可以看出焦面上光阱(光阱1和3)再現(xiàn)效果良好,但離焦光阱(光阱2和4)的再現(xiàn)質(zhì)量非常差.圖2(b)和圖2(c)所示的軸向一維強(qiáng)度曲線清晰地反映了這種現(xiàn)象:離焦光阱的最大強(qiáng)度雖與中間光阱一致,但其分布不再是高斯形狀,而且光斑有明顯的拉長和不對稱性.更糟糕的是,“幽靈光阱”的存在降低了光場調(diào)制效率.圖2(d)所示的利用軸平面GS算法得到的2×2點(diǎn)陣光阱都具有很高的質(zhì)量,即使是在離焦?fàn)顟B(tài)下.圖2(e)和圖2(f)所示的軸向一維強(qiáng)度曲線顯示出每一個(gè)光阱都保持了預(yù)期的高斯分布,而且最大強(qiáng)度基本一致.因此,相比于基于菲涅耳透鏡和閃耀光柵的直接算法,軸平面GS算法可以更為高效、高質(zhì)量地產(chǎn)生軸平面光阱陣列.

圖2 基于菲涅耳透鏡組合的直接算法與軸平面GS算法計(jì)算軸向點(diǎn)陣分布的結(jié)果比較 (a)基于菲涅耳透鏡組合的直接算法計(jì)算的軸向點(diǎn)陣分布結(jié)果;(b)圖(a)中的光阱1,2的軸向一維強(qiáng)度曲線;(c)圖(a)中的光阱3,4的軸向一維強(qiáng)度曲線;(d)軸平面GS算法計(jì)算的軸向點(diǎn)陣分布結(jié)果;(e)圖(d)中的光阱1,2的軸向一維強(qiáng)度曲線;(f)圖(d)中的光阱3,4的軸向一維強(qiáng)度曲線Fig.2.Comparison of results of the axially distributive optical trap array generated by the superposition of Fresnel lens and the axial-plane GS algorithm:(a)Results from the superposition of Fresnel lens;(b)the axial intensity curves of optical traps 1 and 2 in(a);(c)the axial intensity curves of optical traps 3 and 4 in(a);(d)results from the axial-plane GS algorithm;(e)the axial intensity curves of optical traps 1 and 2 in(d);(f)the axial intensity curves of optical traps 3 and 4 in(d).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)裝置

圖3為軸向多光阱捕獲與實(shí)時(shí)觀測系統(tǒng)的光路示意圖.波長為1064 nm,功率為2 W的連續(xù)Nd:YAG固體激光器(P/N:FB-1064,RGBLase LLC,美國)發(fā)出的線偏振光,經(jīng)透鏡1(焦距為10 mm)和2(焦距為100 mm)擴(kuò)束準(zhǔn)直和三角反射器后,進(jìn)入反射式純相位型液晶SLM(PLUTO NIR-II,Holoeye Inc.,德國)進(jìn)行調(diào)制相位.由透鏡3和4(焦距均為200 mm)組成的4f系統(tǒng)將調(diào)制后的光束中繼到高數(shù)值孔徑物鏡1(40×,NA0.95)的入瞳,然后聚焦到樣品溶液里對微球進(jìn)行捕獲和操控.樣品池微管(Vitro Tube#8280-50,VitroCom Inc.,美國)中的二氧化硅熒光小球(488/515,BaseLine Inc.,中國)在波長為470 nm的發(fā)光二極管(LED)光源(DC4100,Thorlabs,美國)的激發(fā)下發(fā)射出的熒光,經(jīng)45?微棱鏡反射后被物鏡2(20×,NA0.45)收集,再經(jīng)二向色鏡濾波后,由透鏡6(焦距為300 mm)會聚成像在相機(jī)2(1280 pixels×1024 pixels,5.3×5.3μm2/pixel,60 fps,8 bits,Thorlabs Inc.,美國)上. 橫平面的熒光信號被物鏡1收集,經(jīng)二向色鏡濾波后,由透鏡5(焦距為200 mm)會聚成像在相機(jī)1(1280×1024 pixels,5.3×5.3μm2/pixel,60 fps,8 bits,Thorlabs Inc.,美國)上.利用相機(jī)1和2可以同時(shí)跟蹤粒子的XY平面和XZ平面的位置信息,進(jìn)而對光阱剛度進(jìn)行標(biāo)定.

圖3 基于45?微反射棱鏡的軸平面成像與光學(xué)捕獲顯微系統(tǒng)光路圖Fig.3.Optical layout of simultaneous axial plane imaging and optical trapping system based on a miniature 45?reflector.

3.2 結(jié)果與分析

3.2.1 軸平面與橫平面同時(shí)成像

本文所搭建的基于45?微反射棱鏡的軸平面成像與光學(xué)捕獲系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在橫平面和軸平面同時(shí)對微操縱過程進(jìn)行跟蹤.為證明此功能,我們控制單個(gè)點(diǎn)光阱進(jìn)行了三維動態(tài)微操縱實(shí)驗(yàn).圖4所示是直徑為5μm的二氧化硅微球在橫平面和軸平面的動態(tài)微操縱過程,其中箭頭為微球的移動方向.當(dāng)微球在焦平面沿X方向移動時(shí)(t=0—1 s),我們可以在橫平面(圖4(a))和軸平面(圖4(b))同時(shí)追蹤微球.當(dāng)微球離開焦平面時(shí)(t=3 s),由于物鏡景深有限,橫平面的成像結(jié)果失去了微球的蹤跡,不過我們依然可以在軸平面上觀察到微球.圖4(c)給出了微球在軸平面上的運(yùn)動過程.上述結(jié)果證明了本文所搭建的系統(tǒng)可以同時(shí)在橫平面和軸平面成像和跟蹤微球的能力.

圖4 在橫平面和軸平面同時(shí)觀測微球的動態(tài)微操縱過程 (a)橫平面圖像;(b),(c)軸平面圖像;標(biāo)尺=5μmFig.4.Observation of dynamic micromanipulation of microspheres in the lateral and axial planes simultaneously:(a)Lateral-plane images;(b),(c)axial-plane images.Scale bar=5μm.

圖5 軸平面同時(shí)捕獲四個(gè)二氧化硅微球 (a)—(c)微球整體沿Z方向移動;(d)—(f)微球整體沿X方向移動;標(biāo)尺=10μmFig.5.Simultaneous trapping of four silica microparticles in the axial plane:(a)–(c)The whole movement of microparticles in Z direction.(d)–(f)the whole movement of microparticles in X direction.Scale bar=10 μm

3.2.2 軸平面多光阱捕獲與動態(tài)操縱

本文所提出的軸平面GS算法可以直接在XZ平面調(diào)制產(chǎn)生光阱陣列.作為例子,我們研究了2×2點(diǎn)光阱陣列的軸平面捕獲與動態(tài)操縱.相鄰兩個(gè)光阱的間距設(shè)為25μm,數(shù)值模擬得到的光場強(qiáng)度分布如圖2(d)所示.利用該光阱陣列的捕獲驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,其中箭頭表示微球的移動方向,虛線為微球1的位置,圓圈中的物體是參照物.通過刷新提前設(shè)計(jì)好的全息圖,我們可以動態(tài)控制被捕獲的二氧化硅微球在軸平面上沿Z和X方向移動,如圖5(a)—(c)和圖5(d)—(f)所示.在圖5(a)—(c)中,不同的虛線表示微球1沿Z方向移動時(shí)的位置.由圖5(a)—(c)可以看出,微球在沿Z方向移動的過程中保持著被穩(wěn)定捕獲的狀態(tài).同樣,在圖5(d)—(f)中,微球在沿X方向移動的過程中也處于穩(wěn)定束縛狀態(tài)態(tài).微球在軸平面上的移動過程證明了利用軸平面GS算法產(chǎn)生的四個(gè)光阱對微球具有三維穩(wěn)定捕獲能力.

3.2.3 光阱剛度的標(biāo)定

光阱的力學(xué)特性對于光學(xué)捕獲的應(yīng)用具有重要意義.通過標(biāo)定光阱的力學(xué)特性,光鑷可以對微觀粒子實(shí)施可控的作用力和操縱.要測量微粒在光阱中的受力,首先需要標(biāo)定光阱剛度,而標(biāo)定光阱剛度首先要獲取粒子的布朗運(yùn)動信息.一種方法是利用四象探測器快速跟蹤粒子,但每次只能跟蹤一個(gè)粒子.另一種方法是視頻跟蹤法,可同時(shí)跟蹤多個(gè)粒子的運(yùn)動,缺點(diǎn)是跟蹤速度較慢.不過對于本文所研究的軸向多光阱捕獲,視頻跟蹤法顯然是最好的選擇.

圖6 軸向四個(gè)光阱的軸平面微球運(yùn)動位置分布圖 (a)光阱1;(b)光阱2;(c)光阱3;(d)光阱4Fig.6.Position charts of the trapped beads in the axial plane:(a)Trap 1;(b)trap 2;(c)trap 3;(d)trap 4.

表1 軸向2×2光阱陣列的光阱剛度標(biāo)定結(jié)果Table 1.The calib rated stiffness of 2×2 axial optical trap array.

通過軸平面實(shí)時(shí)成像技術(shù)可以記錄微球的軸平面運(yùn)動視頻.利用中心定位算法求出視頻每一幀中微球的位置,將這些位置統(tǒng)計(jì)疊加起來便可以得到微球的位置分布信息.由圖6給出的微球位置分布圖可以看出,微球1和2的位置分布相對集中,橫向位置主要集中在[?0.1,0.1]μm,軸向位置主要分布在[?0.15,0.15]μm.粒子3和4的位置分布較為分散,橫向位置主要分布在[?0.15,0.15]μm區(qū)間,軸向位置主要分布在[?0.17,0.17]μm區(qū)間.由此可以判斷,光阱1和2的剛度比3和4的稍大.

進(jìn)一步通過熱力學(xué)噪聲法對光鑷的光阱剛度進(jìn)行了標(biāo)定[27].微球在光阱中的布朗運(yùn)動位移量x滿足均分定理:

其中,kB為玻爾茲曼常數(shù),T為絕對溫度,x為被捕獲微球偏離其平衡位置的距離(一維),κ為光阱剛度.根據(jù)圖6的微球布朗運(yùn)動信息可以計(jì)算得到各個(gè)微球位置偏移量的均方差,代入(3)式可以計(jì)算得到四個(gè)光阱的橫向與軸向光阱剛度,結(jié)果如表1所引,κX和κZ分別表示橫向光阱剛度和軸向光阱剛度,實(shí)驗(yàn)溫度為20?C.四個(gè)光阱剛度相差不大,光阱1和2的橫向和軸向光阱剛度分別是光阱鑷3和4的1.2倍和1.1倍.這是由于通過軸平面GS算法產(chǎn)生的2×2光阱陣列中的光阱強(qiáng)度分布相差不大,光阱1和2的峰值強(qiáng)度相對較高,光阱3和4的相對較低.

4 結(jié) 論

本文提出了一種直接觀測的軸平面成像技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)對樣品軸平面的清晰成像.將全息光鑷技術(shù)與直接軸平面成像技術(shù)相結(jié)合,可以直接觀察到軸平面上微粒的微操縱過程,解決了傳統(tǒng)光鑷系統(tǒng)由于使用單個(gè)物鏡同時(shí)進(jìn)行光學(xué)捕獲與顯微成像時(shí),無法同時(shí)觀察到沿光軸方向捕獲多個(gè)微粒的問題.本文提出的軸平面傅里葉變換GS迭代算法可以快速、高效地直接在軸平面產(chǎn)生光阱陣列,而且所產(chǎn)生的點(diǎn)光阱都具有高斯強(qiáng)度分布,優(yōu)于基于菲涅耳透鏡的直接算法,實(shí)現(xiàn)了對多個(gè)二氧化硅微球的軸向同時(shí)捕獲與監(jiān)控,并標(biāo)定了它們的光阱剛度.本文所提出的軸平面多光阱光學(xué)捕獲和直接觀測技術(shù),拓展了光學(xué)捕獲的功能,在生物醫(yī)學(xué)、物理學(xué)等研究領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用前景.