軸向多光阱微粒捕獲與實時直接觀測技術(shù)?

王玥 梁言生 嚴(yán)紹輝 曹志良 蔡亞楠 張艷 姚保利 雷銘

1)(中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機械研究所,瞬態(tài)光學(xué)與光子技術(shù)國家重點實驗室,西安 710119)

2)(中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

傳統(tǒng)的光鑷技術(shù)使用單個物鏡同時進行光學(xué)捕獲與顯微成像,使得捕獲與成像區(qū)域被限制在物鏡焦平面附近,無法同時觀察到沿光軸方向(即Z向)捕獲的多個微粒.本文提出一種軸平面(X Z平面)Gerchberg-Saxton迭代算法來產(chǎn)生沿軸向分布的多光阱陣列,將軸平面成像技術(shù)與光鑷結(jié)合,實現(xiàn)了沿軸向?qū)Χ趸栉⑶虻亩喙廒逋瑫r捕獲與實時觀測.通過視頻分析法測量了多個二氧化硅微球在軸向光鑷陣列中的布朗運動,并標(biāo)定了光阱剛度.本文提出的軸向多光阱微粒捕獲與實時觀測技術(shù)為光學(xué)微操縱提供了一個新的觀測視角和操縱方法,為生物醫(yī)學(xué)、物理學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究提供了一種新的技術(shù)手段.

1 引 言

自1986年Ashkin等[1]發(fā)現(xiàn)光場梯度力可捕獲微小電介質(zhì)粒子進而提出光鑷概念以來,光鑷技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)[2?5]和物理學(xué)[6?9]等研究領(lǐng)域.例如,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,它可以用來研究活體細胞和生物大分子的個體行為;在原子物理研究中,它可以用來捕獲和冷卻原子,研究玻色-愛因斯坦凝聚.利用衍射光學(xué)元件調(diào)制入射光的波前可以產(chǎn)生三維光阱陣列,同時對多個微粒進行復(fù)雜的三維空間微操縱[10].

微粒的三維空間動態(tài)微操縱使光鑷技術(shù)在實際研究中具有極高的應(yīng)用價值.但傳統(tǒng)的光鑷技術(shù)使用單個物鏡同時進行光學(xué)捕獲與顯微成像,使得捕獲與成像區(qū)域被限制在物鏡焦平面附近,無法同時觀察到沿軸向捕獲和排列的多個微粒,限制了光鑷捕獲的應(yīng)用.三維成像技術(shù)是可能的解決方法.以激光共聚焦技術(shù)為代表的點掃描顯微成像技術(shù)利用高度聚焦的激光束對樣品進行逐點掃描,激發(fā)出的熒光信號經(jīng)過探測孔濾波后被光電倍增管探測收集,最后將所有信號重新組合生成一個三維圖像.這種方法成像速率較低,不滿足光鑷快速成像的需要[11].以結(jié)構(gòu)光照明顯微[12]、光片顯微[13]為代表的寬場成像技術(shù)可以快速獲取樣品的三維信息,但需沿光軸(Z)方向逐層拍攝樣品的多個橫平面(XY平面)二維圖像,再提取軸平面(XZ平面)的信息,仍不滿足光學(xué)捕獲的實時成像要求.2007年,牛津大學(xué)的Wilson等[14,15]提出了一種可以實現(xiàn)快速三維成像的遠距離聚焦顯微成像技術(shù).該技術(shù)使用一對完全相同的顯微物鏡,利用兩個物鏡補償?shù)谝粋€物鏡引入的球差,因而可以在第二個物鏡的焦區(qū)得到樣品的完美實像,再使用一個平面鏡對這個三維實像進行高速推掃便可以獲得樣品的三維實像.這種成像方法不需要移動樣品,平移臺的掃描速率可以達到千赫茲,成像速度大大提升.同時,遠距離聚焦技術(shù)還可以實現(xiàn)快速軸平面成像和任意平面成像[16,17].2014年,牛津大學(xué)的Curran等[18]與Wilson團隊合作,將遠距離聚焦顯微成像技術(shù)應(yīng)用在全息光鑷技術(shù)中,實現(xiàn)了多個微粒的三維捕獲與實時成像.但集成后的成像系統(tǒng)需要三個高數(shù)值孔徑物鏡才可以實現(xiàn)三維成像,導(dǎo)致整個光學(xué)系統(tǒng)的透過率不高.另外高數(shù)值孔徑物鏡的視場很小,軸向的觀測距離十分有限.

本文提出了一種直接觀測軸平面的方法,并將此與全息光鑷技術(shù)相結(jié)合,可以直接觀察軸平面上微粒的操縱過程.為實現(xiàn)穩(wěn)定的軸向多光阱捕獲,本文提出了基于軸平面傅里葉變換的Gerchberg-Saxton(GS)迭代算法.與透鏡光柵組合法等直接算法相比較,此算法具有更高的調(diào)制效率,所產(chǎn)生的沿軸向分布的多光阱陣列具有更銳利的強度分布.理論上,利用軸平面GS算法產(chǎn)生的點光阱具有理想的高斯強度分布;實驗上,實現(xiàn)了對多個二氧化硅微球的軸向同時捕獲與光阱剛度的標(biāo)定.

2 軸平面多光阱產(chǎn)生的基本原理

全息光鑷技術(shù)的核心是通過衍射光學(xué)元件來調(diào)制入射光的相位分布,使調(diào)制后的光場經(jīng)物鏡的傅里葉變換作用后在物鏡的后焦面上形成所需的目標(biāo)光場分布[19,20].隨著光鑷技術(shù)的發(fā)展,全息光鑷技術(shù)不僅要求在物鏡后焦面上產(chǎn)生光阱,而且要求光阱具有三維空間分布,特別是軸平面技術(shù)的發(fā)展要求可以實現(xiàn)在任一軸平面上產(chǎn)生所需要的光阱陣列.如圖1所示,本文中所提到的Z方向為光軸方向;與光軸方向垂直的平面為XY平面,本文中稱為橫平面;與光軸方向平行的平面為XZ平面,本文中稱為軸平面.

三維光阱陣列的產(chǎn)生可以采用光柵透鏡疊加的方法[21,22],通過光柵相位因子可以控制光阱的橫向移動,菲涅耳透鏡相位因子可以控制光阱的軸向移動.該算法簡單快速,但再現(xiàn)質(zhì)量隨光阱復(fù)雜程度的增加而急速下降.另一種常用方法是迭代算法[23,24],例如傳統(tǒng)的三維GS算法.這種方法需要將三維目標(biāo)場分割成多個橫平面,然后通過GS算法分別計算每一平面光場的相位全息圖,最后將所有全息圖疊加合成,因此計算量巨大[25].為快速高效地產(chǎn)生特定的軸平面光場分布,本文提出一種直接調(diào)控軸平面光場強度分布的GS迭代算法,即軸平面GS算法.此算法具有很高的調(diào)制效率,所產(chǎn)生的多光阱陣列具有比直接算法更銳利的強度分布.同時,該算法的計算量要比三維GS算法的計算量小得多.

圖1 捕獲區(qū)域的空間坐標(biāo)系示意圖Fig.1.Schematic diagram of space coordinate system in trapping volum e.

軸平面GS算法是基于軸平面傅里葉變換公式的迭代算法,下面給出簡單的推導(dǎo)過程.用ψH(kx,ky)和ψT(x,y,z)分別表示調(diào)制光場和目標(biāo)光場,其中(kx,ky)和(x,y,z)分別表示SLM平面和焦區(qū)的坐標(biāo).根據(jù)理查德沃爾夫衍射理論[26],焦場可以寫為

這里C是常數(shù),(kx,ky)=k(u/fv/f)是橫向波數(shù),k和f表示波數(shù)和焦距,z=0表示焦平面.縱向波數(shù)與橫向波數(shù)滿足關(guān)系積分區(qū)域為其中A表示捕獲物鏡的數(shù)值孔徑.

下面對(1)式中的積分進行轉(zhuǎn)換,使其更適合于軸平面快速傅里葉變換(axial-plane Fourier transform,FT),即通過dkxdky=(k/|ky|)dkxdkz將積分變量改為kx和kz,令y=0,(1)式中的積分變?yōu)?/p>

橫向波數(shù)ky滿足為積分區(qū)域.變換后的軸平面上的光場ψT(xz)被表達為變量kx和kz的角譜積分,可以通過FT來計算.但(2)式中的角譜函數(shù)是ψH(kx,ky)和ψH(kx,?ky)之和,即ψH分別在ky>0和ky<0區(qū)域的值,而(2)式中積分項的傅里葉逆變換不足以明確定義所以為了明確定義,我們假設(shè)ψH關(guān)于ky對稱,即,角譜函數(shù)ψH(kx,ky)和加載到空間光調(diào)制器上的調(diào)制光場可以就此確定,從而得到軸平面上的焦場ψT(x,0,z).

基于(2)式中的積分變換,通過調(diào)制輸入光場ψH(kx,ky)便可以產(chǎn)生設(shè)定的軸平面焦場ψT(x,0,z).將該變換應(yīng)用到經(jīng)典的GS算法中,便可以快速、高效地在軸平面上直接產(chǎn)生任意光場.

為了驗證軸平面GS算法的有效性,我們對比了這種算法與基于菲涅耳透鏡的直接算法的理論光場結(jié)果,如圖2所示,所用聚焦透鏡的數(shù)值孔徑為0.95.圖2(a)給出了基于菲涅耳透鏡組合的直接算法的結(jié)果,可以看出焦面上光阱(光阱1和3)再現(xiàn)效果良好,但離焦光阱(光阱2和4)的再現(xiàn)質(zhì)量非常差.圖2(b)和圖2(c)所示的軸向一維強度曲線清晰地反映了這種現(xiàn)象:離焦光阱的最大強度雖與中間光阱一致,但其分布不再是高斯形狀,而且光斑有明顯的拉長和不對稱性.更糟糕的是,“幽靈光阱”的存在降低了光場調(diào)制效率.圖2(d)所示的利用軸平面GS算法得到的2×2點陣光阱都具有很高的質(zhì)量,即使是在離焦?fàn)顟B(tài)下.圖2(e)和圖2(f)所示的軸向一維強度曲線顯示出每一個光阱都保持了預(yù)期的高斯分布,而且最大強度基本一致.因此,相比于基于菲涅耳透鏡和閃耀光柵的直接算法,軸平面GS算法可以更為高效、高質(zhì)量地產(chǎn)生軸平面光阱陣列.

圖2 基于菲涅耳透鏡組合的直接算法與軸平面GS算法計算軸向點陣分布的結(jié)果比較 (a)基于菲涅耳透鏡組合的直接算法計算的軸向點陣分布結(jié)果;(b)圖(a)中的光阱1,2的軸向一維強度曲線;(c)圖(a)中的光阱3,4的軸向一維強度曲線;(d)軸平面GS算法計算的軸向點陣分布結(jié)果;(e)圖(d)中的光阱1,2的軸向一維強度曲線;(f)圖(d)中的光阱3,4的軸向一維強度曲線Fig.2.Comparison of results of the axially distributive optical trap array generated by the superposition of Fresnel lens and the axial-plane GS algorithm:(a)Results from the superposition of Fresnel lens;(b)the axial intensity curves of optical traps 1 and 2 in(a);(c)the axial intensity curves of optical traps 3 and 4 in(a);(d)results from the axial-plane GS algorithm;(e)the axial intensity curves of optical traps 1 and 2 in(d);(f)the axial intensity curves of optical traps 3 and 4 in(d).

3 實驗結(jié)果

3.1 實驗裝置

圖3為軸向多光阱捕獲與實時觀測系統(tǒng)的光路示意圖.波長為1064 nm,功率為2 W的連續(xù)Nd:YAG固體激光器(P/N:FB-1064,RGBLase LLC,美國)發(fā)出的線偏振光,經(jīng)透鏡1(焦距為10 mm)和2(焦距為100 mm)擴束準(zhǔn)直和三角反射器后,進入反射式純相位型液晶SLM(PLUTO NIR-II,Holoeye Inc.,德國)進行調(diào)制相位.由透鏡3和4(焦距均為200 mm)組成的4f系統(tǒng)將調(diào)制后的光束中繼到高數(shù)值孔徑物鏡1(40×,NA0.95)的入瞳,然后聚焦到樣品溶液里對微球進行捕獲和操控.樣品池微管(Vitro Tube#8280-50,VitroCom Inc.,美國)中的二氧化硅熒光小球(488/515,BaseLine Inc.,中國)在波長為470 nm的發(fā)光二極管(LED)光源(DC4100,Thorlabs,美國)的激發(fā)下發(fā)射出的熒光,經(jīng)45?微棱鏡反射后被物鏡2(20×,NA0.45)收集,再經(jīng)二向色鏡濾波后,由透鏡6(焦距為300 mm)會聚成像在相機2(1280 pixels×1024 pixels,5.3×5.3μm2/pixel,60 fps,8 bits,Thorlabs Inc.,美國)上. 橫平面的熒光信號被物鏡1收集,經(jīng)二向色鏡濾波后,由透鏡5(焦距為200 mm)會聚成像在相機1(1280×1024 pixels,5.3×5.3μm2/pixel,60 fps,8 bits,Thorlabs Inc.,美國)上.利用相機1和2可以同時跟蹤粒子的XY平面和XZ平面的位置信息,進而對光阱剛度進行標(biāo)定.

圖3 基于45?微反射棱鏡的軸平面成像與光學(xué)捕獲顯微系統(tǒng)光路圖Fig.3.Optical layout of simultaneous axial plane imaging and optical trapping system based on a miniature 45?reflector.

3.2 結(jié)果與分析

3.2.1 軸平面與橫平面同時成像

本文所搭建的基于45?微反射棱鏡的軸平面成像與光學(xué)捕獲系統(tǒng)可以實現(xiàn)在橫平面和軸平面同時對微操縱過程進行跟蹤.為證明此功能,我們控制單個點光阱進行了三維動態(tài)微操縱實驗.圖4所示是直徑為5μm的二氧化硅微球在橫平面和軸平面的動態(tài)微操縱過程,其中箭頭為微球的移動方向.當(dāng)微球在焦平面沿X方向移動時(t=0—1 s),我們可以在橫平面(圖4(a))和軸平面(圖4(b))同時追蹤微球.當(dāng)微球離開焦平面時(t=3 s),由于物鏡景深有限,橫平面的成像結(jié)果失去了微球的蹤跡,不過我們依然可以在軸平面上觀察到微球.圖4(c)給出了微球在軸平面上的運動過程.上述結(jié)果證明了本文所搭建的系統(tǒng)可以同時在橫平面和軸平面成像和跟蹤微球的能力.

圖4 在橫平面和軸平面同時觀測微球的動態(tài)微操縱過程 (a)橫平面圖像;(b),(c)軸平面圖像;標(biāo)尺=5μmFig.4.Observation of dynamic micromanipulation of microspheres in the lateral and axial planes simultaneously:(a)Lateral-plane images;(b),(c)axial-plane images.Scale bar=5μm.

圖5 軸平面同時捕獲四個二氧化硅微球 (a)—(c)微球整體沿Z方向移動;(d)—(f)微球整體沿X方向移動;標(biāo)尺=10μmFig.5.Simultaneous trapping of four silica microparticles in the axial plane:(a)–(c)The whole movement of microparticles in Z direction.(d)–(f)the whole movement of microparticles in X direction.Scale bar=10 μm

3.2.2 軸平面多光阱捕獲與動態(tài)操縱

本文所提出的軸平面GS算法可以直接在XZ平面調(diào)制產(chǎn)生光阱陣列.作為例子,我們研究了2×2點光阱陣列的軸平面捕獲與動態(tài)操縱.相鄰兩個光阱的間距設(shè)為25μm,數(shù)值模擬得到的光場強度分布如圖2(d)所示.利用該光阱陣列的捕獲驗結(jié)果如圖5所示,其中箭頭表示微球的移動方向,虛線為微球1的位置,圓圈中的物體是參照物.通過刷新提前設(shè)計好的全息圖,我們可以動態(tài)控制被捕獲的二氧化硅微球在軸平面上沿Z和X方向移動,如圖5(a)—(c)和圖5(d)—(f)所示.在圖5(a)—(c)中,不同的虛線表示微球1沿Z方向移動時的位置.由圖5(a)—(c)可以看出,微球在沿Z方向移動的過程中保持著被穩(wěn)定捕獲的狀態(tài).同樣,在圖5(d)—(f)中,微球在沿X方向移動的過程中也處于穩(wěn)定束縛狀態(tài)態(tài).微球在軸平面上的移動過程證明了利用軸平面GS算法產(chǎn)生的四個光阱對微球具有三維穩(wěn)定捕獲能力.

3.2.3 光阱剛度的標(biāo)定

光阱的力學(xué)特性對于光學(xué)捕獲的應(yīng)用具有重要意義.通過標(biāo)定光阱的力學(xué)特性,光鑷可以對微觀粒子實施可控的作用力和操縱.要測量微粒在光阱中的受力,首先需要標(biāo)定光阱剛度,而標(biāo)定光阱剛度首先要獲取粒子的布朗運動信息.一種方法是利用四象探測器快速跟蹤粒子,但每次只能跟蹤一個粒子.另一種方法是視頻跟蹤法,可同時跟蹤多個粒子的運動,缺點是跟蹤速度較慢.不過對于本文所研究的軸向多光阱捕獲,視頻跟蹤法顯然是最好的選擇.

圖6 軸向四個光阱的軸平面微球運動位置分布圖 (a)光阱1;(b)光阱2;(c)光阱3;(d)光阱4Fig.6.Position charts of the trapped beads in the axial plane:(a)Trap 1;(b)trap 2;(c)trap 3;(d)trap 4.

表1 軸向2×2光阱陣列的光阱剛度標(biāo)定結(jié)果Table 1.The calib rated stiffness of 2×2 axial optical trap array.

通過軸平面實時成像技術(shù)可以記錄微球的軸平面運動視頻.利用中心定位算法求出視頻每一幀中微球的位置,將這些位置統(tǒng)計疊加起來便可以得到微球的位置分布信息.由圖6給出的微球位置分布圖可以看出,微球1和2的位置分布相對集中,橫向位置主要集中在[?0.1,0.1]μm,軸向位置主要分布在[?0.15,0.15]μm.粒子3和4的位置分布較為分散,橫向位置主要分布在[?0.15,0.15]μm區(qū)間,軸向位置主要分布在[?0.17,0.17]μm區(qū)間.由此可以判斷,光阱1和2的剛度比3和4的稍大.

進一步通過熱力學(xué)噪聲法對光鑷的光阱剛度進行了標(biāo)定[27].微球在光阱中的布朗運動位移量x滿足均分定理:

其中,kB為玻爾茲曼常數(shù),T為絕對溫度,x為被捕獲微球偏離其平衡位置的距離(一維),κ為光阱剛度.根據(jù)圖6的微球布朗運動信息可以計算得到各個微球位置偏移量的均方差,代入(3)式可以計算得到四個光阱的橫向與軸向光阱剛度,結(jié)果如表1所引,κX和κZ分別表示橫向光阱剛度和軸向光阱剛度,實驗溫度為20?C.四個光阱剛度相差不大,光阱1和2的橫向和軸向光阱剛度分別是光阱鑷3和4的1.2倍和1.1倍.這是由于通過軸平面GS算法產(chǎn)生的2×2光阱陣列中的光阱強度分布相差不大,光阱1和2的峰值強度相對較高,光阱3和4的相對較低.

4 結(jié) 論

本文提出了一種直接觀測的軸平面成像技術(shù),可以實現(xiàn)對樣品軸平面的清晰成像.將全息光鑷技術(shù)與直接軸平面成像技術(shù)相結(jié)合,可以直接觀察到軸平面上微粒的微操縱過程,解決了傳統(tǒng)光鑷系統(tǒng)由于使用單個物鏡同時進行光學(xué)捕獲與顯微成像時,無法同時觀察到沿光軸方向捕獲多個微粒的問題.本文提出的軸平面傅里葉變換GS迭代算法可以快速、高效地直接在軸平面產(chǎn)生光阱陣列,而且所產(chǎn)生的點光阱都具有高斯強度分布,優(yōu)于基于菲涅耳透鏡的直接算法,實現(xiàn)了對多個二氧化硅微球的軸向同時捕獲與監(jiān)控,并標(biāo)定了它們的光阱剛度.本文所提出的軸平面多光阱光學(xué)捕獲和直接觀測技術(shù),拓展了光學(xué)捕獲的功能,在生物醫(yī)學(xué)、物理學(xué)等研究領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用前景.