野黃芩苷對阿爾茨海默病小鼠的治療作用

田世元 邵 玉 張璐妮 張玉影 陳加俊 劉曉陽

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，吉林 長春 130033)

野黃芩苷(SCU)是從黃芩莖葉、燈盞和細(xì)辛等藥物中分離得到的一種黃酮類化合物。目前，普遍認(rèn)為SCU對心腦血管系統(tǒng)具有較好的調(diào)節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn)，SCU具有抗氧化應(yīng)激〔1〕、調(diào)節(jié)鈣離子〔2〕、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)〔3〕等作用。在心肌保護(hù)方面，研究證明長期使用SCU可以抑制心肌間質(zhì)纖維化，其主要途徑包括抑制纖維連接蛋白(FN)1、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的表達(dá)和p38-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2 的磷酸化，進(jìn)而改善心肌梗死小鼠的心臟功能〔4〕。在促進(jìn)新生血管形成方面，SCU可調(diào)節(jié)血小板內(nèi)皮黏附分子、誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的活化及表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖〔5〕。在神經(jīng)保護(hù)方面，SCU可明顯改善缺血性腦卒中患者的臨床表現(xiàn)。動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，SCU在大鼠瞬時(shí)腦缺血時(shí)可以通過抑制聚ADP 核糖聚合酶(PARP)依賴的線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的易位，減輕腦損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)〔6〕。但在行為和認(rèn)知方面，有關(guān)SCU的作用還未曾報(bào)道。本文旨在成功建立阿爾茨海默病(AD)小鼠模型，探討SCU對AD小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 50只小鼠由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，均為8周齡的昆明種小鼠，雌雄各半，20～30 g。SCU購于中國食品藥品檢定所。Y-型迷宮來自三興聲電公司生產(chǎn)的MG-3型Y型迷宮。

1.2建立小鼠AD模型 在小鼠雙側(cè)海馬內(nèi)注射寡聚態(tài)β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42，將其制成AD模型。通過對Y型迷宮的被動回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，篩選出符合實(shí)驗(yàn)要求的AD模型小鼠。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)體重不同隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組(寡聚態(tài) Aβ1～42 0.1 ml/10 g)、低劑量組(SCU 10 mg/kg)、中劑量組(SCU 20 mg/kg)、高劑量組(SCU 40 mg/kg)各10只，低、中、高劑量組分別于造模后第15天開始給予SCU，持續(xù)給藥15 d。

1.4小鼠學(xué)習(xí)能力和記憶保持的檢測 采用MG-3型Y-型迷宮行暗環(huán)境被動回避反應(yīng)，MG-3型Y-型迷宮由等長(16 cm)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂和三者的交界區(qū)組成，箱底鋪設(shè)直徑0.3 cm、間距1.2 cm的鋁柵，用擋板擋住Ⅲ臂，用黑布包裹Ⅱ和Ⅲ臂形成實(shí)驗(yàn)用暗室；Ⅰ臂頂端裝一盞15 W的白熾燈形成實(shí)驗(yàn)用明室。將小鼠放入明室(Ⅰ臂)中，由于小鼠先天的趨暗習(xí)性，迫使其進(jìn)入暗室；暗室鋁柵通電(0.3 mA、50 Hz)后，受電刺激的小鼠逃回明室，之后重復(fù)上述訓(xùn)練，訓(xùn)練間隔20 s，直至小鼠在明室的停留時(shí)間≥10 min，說明學(xué)會。記錄每組學(xué)會需要的訓(xùn)練次數(shù)，并觀察各組學(xué)習(xí)過程的變化。最后學(xué)習(xí)達(dá)標(biāo)的小鼠休息1 w，于第10天重新開始先前的測試，并記錄小鼠進(jìn)入暗室前在明室停留的時(shí)間(即進(jìn)洞潛伏期)，分析各組休息10 d后的記憶保持能力。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1AD小鼠模型的測試與篩選 模型對照組學(xué)習(xí)和記憶能力明顯低于正常對照組(P< 0.01)，即AD小鼠模型建模成功。見表1。

2.2各組學(xué)習(xí)記憶能力的改變 低、中、高劑量組學(xué)會所需訓(xùn)練次數(shù)均明顯少于模型對照組(P<0.01)，高劑量組與正常對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。停止訓(xùn)練后，低、中、高劑量組進(jìn)洞潛伏期明顯高于模型對照組(P<0.01)，但與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組學(xué)會所需訓(xùn)練次數(shù)及進(jìn)洞潛伏期比較

與正常對照組比較:1)P<0.01

表2 各組學(xué)會所需訓(xùn)練次數(shù)及進(jìn)洞潛伏期比較

與模型對照組比較：1)P<0.01；2)與正常對照組比較：2)P<0.01

3 討 論

AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，原發(fā)性、不可逆性、慢性進(jìn)行性是其發(fā)病特點(diǎn)。AD的主要病理特征為患者大腦皮層和海馬區(qū)因Aβ沉積而形成大量老年斑(SP)，神經(jīng)元胞體內(nèi)可因tau蛋白異常聚集出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)，此外還有神經(jīng)元細(xì)胞的大量丟失，其中SP及NFT 為AD 的兩個(gè)最為典型的病理學(xué)改變〔7〕。AD主要影響患者的認(rèn)知功能及學(xué)習(xí)記憶功能，認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)記憶功能是人類的高級神經(jīng)功能，這些功能的減退或喪失是大腦神經(jīng)元細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志。AD患者臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶功能損傷和認(rèn)知功能障礙。關(guān)于AD的病因及發(fā)病機(jī)制迄今尚無明確定論。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為AD的發(fā)病與多種因素有關(guān)，如年齡、家族遺傳、代謝性因素、雌激素缺乏等。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為AD的發(fā)病可能與膽堿能系統(tǒng)功能減退、谷氨酸(GLU)能神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙、免疫炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。最近研究報(bào)道從基因和分子水平對AD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了闡述，①tau蛋白異常學(xué)說：tau蛋白已經(jīng)被證實(shí)是一種含磷糖蛋白〔8〕，也是一種微管相關(guān)蛋白(MAP)，可與微管結(jié)合并保持微管的穩(wěn)定性。Weingarten等〔8〕在鈍化微管蛋白時(shí)首次分離出了這種蛋白。tau蛋白具有合成和穩(wěn)定神經(jīng)元細(xì)胞的作用，現(xiàn)代分子生物學(xué)已證實(shí)AD患者體內(nèi)tan蛋白表達(dá)明顯增加，這些蛋白通常以過度磷酸化的形式存在。tau 蛋白過度磷酸化假說認(rèn)為，tau 蛋白過度磷酸化在AD 發(fā)病機(jī)制的早期起重要作用〔9〕。tau 蛋白的過度磷酸化加快了tau 蛋白在大腦和腦脊液中的積累并進(jìn)一步形成NFT〔9〕。此外，過度磷酸化的tau 蛋白不僅與tau、MAP1、MAP2 等微管蛋白競爭性地結(jié)合微管從而使微管解聚，微管系統(tǒng)瓦解，影響軸漿的運(yùn)輸功能，而且使自身與微管蛋白的結(jié)合能力下降〔8,9〕。②Aβ 級聯(lián)反應(yīng)學(xué)說：AD是由膜內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)的異常水解和錯(cuò)誤折疊所致的一種淀粉樣變性疾病，Aβ42是其中的一種水解產(chǎn)物，也是主要的致病形式，能導(dǎo)致Aβ沉積，進(jìn)而發(fā)展為SP〔10,11〕。研究顯示，Aβ抑制腦中大分子量蛋白酶的活性，導(dǎo)致Aβ無法降解，這樣就進(jìn)入了一個(gè)Aβ聚積的惡性循環(huán)〔12〕。此外，在AD患者中，Aβ的異常沉積形成免疫原，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，補(bǔ)充和釋放炎性因子，通過直接或間接慢性免疫反應(yīng)的作用，造成神經(jīng)元損害〔13〕。③基因突變學(xué)說：AD患者基因突變通常位于21號染色體、14號染色體和1號染色體上，目前已經(jīng)報(bào)道過的基因突變包括APP基因、載脂蛋白(Apo)E基因、早老素1基因和早老素2基因，其他可能導(dǎo)致AD的基因位點(diǎn)存在于9、10、12和19號染色體上〔14〕。目前被大多數(shù)學(xué)者所接受的是Aβ 級聯(lián)反應(yīng)學(xué)說，即Aβ在大腦內(nèi)特定區(qū)域聚集，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元凋亡、NFT、氧化應(yīng)激及膽堿能系統(tǒng)損傷等一系列病理變化，這些病理性改變在AD的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用〔15,16〕。

目前治療AD的藥物種類繁多，但主要有以下兩大類：膽堿酯酶抑制劑(如：多奈哌齊，加蘭他敏和利伐斯的明)和非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(美金剛)，這些藥物雖然有助于AD患者認(rèn)知功能的改善，但不能阻止進(jìn)行性神經(jīng)變性〔17,18〕。此外，上述藥物均存在輕-中度的副作用，如多奈哌齊的主要不良反應(yīng)有惡心、嘔吐、腹瀉、頭暈、失眠、肌肉痙攣等；美金剛片的常見不良反應(yīng)有幻覺、意識模糊、頭痛、頭暈、疲倦等。SCU藥理作用研究主要集中在其對心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能。它具有對抗氧化應(yīng)激的作用，可以減輕PC12細(xì)胞由氧化應(yīng)激反應(yīng)而引起的細(xì)胞凋亡〔1〕。SCU也具有抗心肌肥厚的藥理作用，可以通過調(diào)控鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)Ⅱ信號通路和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)Ca2+來發(fā)揮抗心肌肥厚〔2〕。SCU還可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)而起到神經(jīng)保護(hù)作用〔3〕。有學(xué)者證實(shí)，SCU在體外可以抑制Aβ聚集，進(jìn)而防止了由Aβ介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔19〕。另外，SCU還可能通過G蛋白耦聯(lián)受體(GPR)30介導(dǎo)的非基因組信號傳導(dǎo)途徑來預(yù)防Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷〔20～22〕。一些SCU具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但抗Aβ聚集和(或)抗Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡沒有明顯效果〔23〕。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到21世紀(jì)中期，全球?qū)⒂?.07億人患AD〔24〕。本研究結(jié)果提示SCU可以明顯提高小鼠的學(xué)習(xí)能力和短期記憶能力，揭示了SCU對神經(jīng)的保護(hù)作用，從而為藥物治療AD提供了新的思路和方法。