甘肅黨參對(duì)衰老模型小鼠脾臟基因表達(dá)的影響

楊柏齡 侯 茜 胡 鋒 張 帆

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室 中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

衰老是由內(nèi)外環(huán)境和遺傳因素等諸多因素相互影響、相互作用而引起的生物學(xué)過程，主要表現(xiàn)為連續(xù)性并隨年齡而增的全身性、漸進(jìn)性、衰退性的形態(tài)變化和功能紊亂〔1〕，對(duì)人的生理病理甚至心理都產(chǎn)生著極大的影響。黨參是甘肅道地藥材，也是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥〔2〕，具有增強(qiáng)記憶能力、學(xué)習(xí)能力；提高免疫力；抗疲勞、抗氧化等藥理作用〔3〕。目前，未見關(guān)于甘肅黨生水煎劑對(duì)衰老模型小鼠脾臟組織基因表達(dá)影響的研究，本實(shí)驗(yàn)用基因芯片研究甘肅黨參水煎劑對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠脾臟組織基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品及試劑 2月齡SPF級(jí)小鼠30只(20±2)g，雄性，昆明種(甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。素花黨參(產(chǎn)自甘肅文縣，甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系晉玲教授鑒定)：制成黨參水煎劑(含生藥濃度為1 g/ml)，置4℃冰箱備用；D-半乳糖購(gòu)自上海中秦試劑有限公司，批號(hào)為20120228。Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，批號(hào)為20110602；RNase試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)，批號(hào)為20120125；全基因組表達(dá)譜芯片(Agilent小鼠4X44K)、雜交試劑盒、溴乙啶，均購(gòu)自上?？党缮锕?。

1.2方法

1.2.1分組及造模 將30只昆明種小鼠隨即分為3組：衰老模型組、空白對(duì)照組、黨參組，每組10只。于小鼠頸背部皮下注射5%D-半乳糖溶液，1 g·kg-1·d-1〔4〕，空白對(duì)照組小鼠每天注射等體積生理鹽水，共42 d。

1.2.2給藥 于造模第11天開始，黨參組灌服黨參水煎劑(15 g·kg-1·d-1)?？瞻讓?duì)照組灌服等量生理鹽水，共計(jì)42 d。

1.2.3取材 頸椎脫臼處死小鼠，快速分離出脾臟，生理鹽水漂洗后即刻轉(zhuǎn)入-20℃冰箱冷凍備用。

1.2.4總mRNA的提取 采用Trizol法〔5〕分別提取空白對(duì)照組、黨參組及衰老模型組的脾臟細(xì)胞總mRNA，并進(jìn)行純化，確保沒有基因組DNA污染。

1.2.5探針制備 采用Agilent表達(dá)譜芯片配套的單色標(biāo)記芯片基因表達(dá)分析方法逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化，分別標(biāo)記各組的總mRNA，并進(jìn)行等量混合。

1.2.6芯片雜交 將芯片滴上雜交液，放入密閉的雜交盒中，于65℃滾動(dòng)雜交17 h，用Agilent公司提供的洗液Ⅰ、Ⅱ洗滌，晾干(室溫)，掃描。采用Agilent Scanner G2505B掃描芯片及GeneSpring GX v11.5.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)信號(hào)比值(Foldchange)，篩選出表達(dá)顯著上調(diào)或下調(diào)的基因。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果 隨機(jī)選擇差異基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因芯片，選擇的目的基因?yàn)椋築cl2、TLR7、IL6RA，管家基因?yàn)椋篏APDH；引物通過ABIPrimerexPress6.0軟件設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證芯片結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1脾臟總mRNA的提取結(jié)果 各組提取的總mRNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定純度，結(jié)果都符合D260/OD280 Ratio>1.8，OD260/OD230 Ratio>2(表1)。空白對(duì)照組、衰老模型組、黨參組小鼠總mRNA的提取質(zhì)控結(jié)果：從OD值分析mRNA甲醛變性凝膠電泳圖(圖1)可以得知，所得的mRNA完整性及純度均較好，沒有明顯降解，符合雜交檢驗(yàn)的要求。

表1 脾臟總mRNA的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

圖1 各組脾臟mRNA甲醛變性凝膠電泳

2.2雜交結(jié)果 雜交芯片經(jīng)掃描儀掃描后獲得芯片掃描圖，圖中的亮點(diǎn)表示高表達(dá)的基因，暗點(diǎn)表示低表達(dá)的基因，三組同一位置放大的芯片掃描圖，表明芯片的雜交過程是成功的。見圖2。

2.3基因表達(dá)差異分析 在包括25 066個(gè)探針在內(nèi)的Agilent小鼠全基因組表達(dá)譜芯片上，以Fold Change≥2.0或≤0.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)空白對(duì)照組、衰老模型組和黨參組的數(shù)據(jù)進(jìn)行信號(hào)值比對(duì)，得到各組上調(diào)及下調(diào)差異基因的總數(shù)目：衰老模型組與空白對(duì)照組比較2 463個(gè)(上調(diào)982個(gè)，下調(diào)1 481個(gè))；黨參組與衰老模型組比較1 540個(gè)(上調(diào)1 126個(gè)，下調(diào)414個(gè))；黨參組與空白對(duì)照組比較666個(gè)(上調(diào)416個(gè)，下調(diào)250個(gè))。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)衰老模型組與空白對(duì)照組、黨參組與空白對(duì)照組有顯著表達(dá)差異的基因從細(xì)胞凋亡及抗細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激應(yīng)答這三個(gè)方面進(jìn)行生物學(xué)功能分析，并通過黨參組與衰老模型組比較，衰老模型組與空白對(duì)照組比較，找出兩組比較中表達(dá)有差異的共同基因篩選黨參作用的靶基因，結(jié)果顯示：黨參組與衰老模型組比較及衰老模型組與空白對(duì)照組比較，表達(dá)有差異的共同基因有36個(gè)，其中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因16個(gè)，其中10個(gè)上調(diào)分別為Bcl2(NM_177410.2)、BIRC5(NM_001012273.1)、RNF7(NM_011279.2)、MKL1(BC050941.1)、PLAGL2(NM_018807.5)、EIF5A(NM_181582.3)、BUB1B(NM_009773.3)、DCC(NM_007831.3)、LGALS7(NM_008496.4)、SQSTM1(NM_011018.2)；6個(gè)下調(diào)，分別為GZMB(NM_013542.2)、PERP(BC021772.1)、KRT8(NM_031170.2)、SEMA6A(NM_018744.2)、MAP3K5(NM_008580.4)、SPP1(NM_001204233.1)；與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因17個(gè)，其中10個(gè)上調(diào)分別為CR2(NM_007758.2)、C1QA(NM_007572.2)、C1QB(NM_009777.2)、H2-DMA(NM_010386.3)、TAP1(NM_013683.2)、H2-Q6(NM_207648.1)、H2-AA(NM_010378.2)、H2-Q10(NM_010391.4)、OAS1B(NM_033541.4)、POU2F2(NM_001163556.1)；7個(gè)下調(diào)分別IL6RA(NM_133211.3)、IL7(NM_008371.4)、CFH(NM_009888.3)、LY96(NM_016923.2)、TLR7(NM_133211.3)、CFD(NM_013459.2)、CCL11(NM_011330.3)；與氧化應(yīng)激應(yīng)答相關(guān)的基因3個(gè)，均為上調(diào)基因分別為GPX1(NM_008160.5)、GPX4(NM_008162.2)、TXNIP(NM_023719.2)；黨參組與空白對(duì)照組比較，上述36個(gè)基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。結(jié)果表明，這36個(gè)基因的表達(dá)水平受到黨參用藥的影響。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果

2.4.1各組基因擴(kuò)增曲線 從圖3看出，拷貝數(shù)不同的模板隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，逐漸增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度，曲線經(jīng)過一段指數(shù)擴(kuò)增期后趨于平行(出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng))，模板的拷貝數(shù)和熒光累積值的對(duì)應(yīng)關(guān)系在指數(shù)擴(kuò)增期形成了定量的基礎(chǔ)，各基因擴(kuò)增曲線都有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期且曲線平滑，說(shuō)明該檢測(cè)具有較好的敏感性。

2.4.2各組基因溶解曲線 圖4橫軸表示溫度，縱軸表示熒光強(qiáng)度，各基因溶解曲線均呈單一峰，且有較銳利的波，其他引物二聚體及非特異性熒光信號(hào)未被檢出，說(shuō)明PCR擴(kuò)增特異性較好。

空白對(duì)照組

衰老模型組

黨參組

圖3 各組基因的擴(kuò)增曲線

圖4 各組基因的溶解曲線

2.4.3分析結(jié)果 各基因擴(kuò)增曲線平滑且指數(shù)擴(kuò)增期明顯，說(shuō)明該檢測(cè)敏感性較好。各基因溶解曲線都呈單一峰，說(shuō)明擴(kuò)增的產(chǎn)物單一，表明有較好的擴(kuò)增特異性，檢測(cè)重復(fù)了3次，循環(huán)閾值(Ct) 由儀器自動(dòng)讀取，說(shuō)明方法穩(wěn)定，結(jié)果的重復(fù)性好，以Ct平均值作為最后的Ct測(cè)量結(jié)果，用△△Ct相對(duì)定量法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，所測(cè)目的基因在3組樣本中的2-△Ct的數(shù)值比較，見表2。黨參用藥后，基因Bcl2表達(dá)上調(diào)(在衰老模型組表達(dá)下調(diào))，IL6RA和TLR7表達(dá)下調(diào)(在衰老模型組表達(dá)上調(diào))，基因芯片的結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明基因芯片結(jié)果可靠。

表2 衰老模型組、黨參組分別與空白對(duì)照組比較 Bcl2、 IL6RA、TLR7的2-△Ct數(shù)值比

3 討 論

延緩衰老和預(yù)防老年病在我國(guó)人口老齡化日趨顯著的背景下顯得尤為重要，對(duì)衰老機(jī)制的研究自古有之，中醫(yī)學(xué)提出了腎虛學(xué)說(shuō)、脾虛學(xué)說(shuō)等理論，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)衰老的機(jī)制也提出了免疫學(xué)說(shuō)、氧化自由基學(xué)說(shuō)、凋亡學(xué)說(shuō)等各種理論〔6〕。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，故又稱編程性細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，受黨參用藥影響的36個(gè)基因中有16個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)，如Bcl-2是Bcl-2家族蛋白的重要成員，屬于抑制凋亡亞族成員，位于細(xì)胞的核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體膜上，人體內(nèi)許多組織中如神經(jīng)元都存在著Bcl-2基因的表達(dá)，并且許多組織在進(jìn)行包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的自我更新時(shí)也有Bcl-2基因的表達(dá)，Bcl-2基因的表達(dá)具有抑制細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞生存期的作用〔7〕。在衰老模型小鼠脾臟中該基因表達(dá)顯著下調(diào)，而在黨參用藥后，該基因的表達(dá)顯著上調(diào)，提示甘肅黨參可能通過控制細(xì)胞凋亡來(lái)延緩機(jī)體衰老。

衰老的免疫學(xué)說(shuō)認(rèn)為免疫系統(tǒng)的中樞器官是胸腺，它的衰退可以使T淋巴細(xì)胞減少，整體免疫功能下降，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老。與機(jī)體免疫有關(guān)的另一個(gè)重要免疫器官是脾臟，脾臟的功能與機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫都密切相關(guān)；中醫(yī)認(rèn)為脾為后天之本，氣血生化之源，在人體五臟中占有很重要的地位。本研究結(jié)果表明36個(gè)在衰老模型組中表達(dá)有明顯差異的基因，在空白對(duì)照組表達(dá)沒有明顯變化，表明這36個(gè)基因與衰老相關(guān)，其中與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因有17個(gè)，如IL-6是一種多效能細(xì)胞因子，是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體及免疫反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)等方面起重要作用〔8〕。機(jī)體IL-6濃度的異常升高可引起一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫功能的紊亂，加速衰老進(jìn)程，是動(dòng)脈粥樣硬化、老年癡呆等疾病的主要原因〔9〕。本研究中衰老小鼠脾臟組織IL-6基因表達(dá)顯著上調(diào)，用甘肅黨參水煎劑干預(yù)后衰老小鼠脾臟細(xì)胞IL-6基因表達(dá)顯著下調(diào),揭示了甘肅黨參可能通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來(lái)延緩機(jī)體的衰老。

自由基學(xué)說(shuō)是具有代表性的衰老學(xué)說(shuō)之一，隨著年齡不斷增長(zhǎng),自由基平衡逐漸遭到破壞，過量的自由基受到各種生物大分子過氧化作用攻擊，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)和核酸分子交聯(lián)，基因突變或DNA復(fù)制異常，最終導(dǎo)致細(xì)胞的正常功能被嚴(yán)重破壞，以至衰老、死亡。本研究結(jié)果顯示，受黨參用藥影響的36個(gè)基因中有3個(gè)與氧化應(yīng)激相關(guān)，如GPX-1，是細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶1的基因，谷胱甘肽過氧化物酶可利用谷胱甘肽作為還原劑，將機(jī)體內(nèi)過氧化氫或脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)樗蜉^穩(wěn)定的脂類烴基化合物，阻斷活性氧對(duì)機(jī)體的損傷〔10〕，從而延緩衰老。本研究結(jié)果中，衰老小鼠脾臟細(xì)胞中GPX-1基因表達(dá)顯著下調(diào)，經(jīng)黨參作用后衰老小鼠脾臟細(xì)胞GPX-1基因表達(dá)顯著上調(diào)，揭示了甘肅黨參可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激應(yīng)答來(lái)延緩機(jī)體的衰老進(jìn)程。