重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜免疫屏障的變化及甘露糖的干預(yù)效果

姚金鋒 白 婧 郭 昱 崔東來

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

重癥急性胰腺炎病理變化復(fù)雜，病情比較危重，死亡率較高〔1,2〕。重癥急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)除損害胰腺組織外，對鄰近組織器官也有損害作用。腸道黏膜屏障由生物屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和機(jī)械屏障構(gòu)成，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障，可以防止腸道內(nèi)病原體和有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)。急性胰腺炎時(shí)腸黏膜上皮細(xì)胞膜和細(xì)胞之間的機(jī)械屏障被破壞，從而引起腸黏膜屏障損傷〔3,4〕，但急性胰腺炎引起腸黏膜屏障損傷的機(jī)制尚不十分清楚。甘露糖具有抑制傷口愈合處炎癥反應(yīng)及抑制中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)的作用。本文對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜免疫屏障的變化情況進(jìn)行研究，并對其給予甘露糖治療，觀察甘露糖對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障損害的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)、雄性、SD大鼠30只，體重270～310 g，實(shí)驗(yàn)前常規(guī)飲水和進(jìn)食。主要試劑和儀器：?；悄懰徕c、D-甘露糖(美國Sigma公司)，大鼠分泌性免疫球蛋白(sIg)A放射免疫分析試劑盒、大鼠甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-4 ELISA試劑盒(上海西塘生物有限公司)等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組 將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、胰腺炎組(重癥急性胰腺炎組)和甘露糖組(重癥急性胰腺炎+甘露糖干預(yù)組)，每組10只。

1.2.2重癥急性胰腺炎模型的建立 采用戊巴比妥鈉對大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)麻醉，麻醉成功后常規(guī)備皮消毒，取各大鼠上腹部正中切口進(jìn)入腹腔，分離膽胰管并結(jié)扎膽胰管肝門端。暴露并分離膽胰管十二指腸端，膽胰管內(nèi)進(jìn)針動(dòng)靜脈留置針，結(jié)扎后拔除針芯，向膽胰管內(nèi)以0.2 ml/min速度注射3%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g)，見胰腺腫脹壞死后向空腸內(nèi)注射氯化鈉溶液，0.5 ml/100 g，然后拔出穿刺針，逐層關(guān)腹。甘露糖組大鼠在重癥急性胰腺炎模型造模成功后經(jīng)尾靜脈注射10%D-甘露糖。假手術(shù)組大鼠僅開腹、翻動(dòng)胰腺和腸管、穿刺、關(guān)腹。

1.2.3標(biāo)本制備 三組大鼠術(shù)后均經(jīng)背部皮膚補(bǔ)液，術(shù)后12 h麻醉各組大鼠，進(jìn)腹后經(jīng)下腔靜脈穿刺采血用于內(nèi)毒素、淀粉酶、瘦素水平和sIgA、MBL、IL-4水平測定，取材胰腺和回腸末端進(jìn)行相應(yīng)檢查。

1.2.4胰腺組織和回腸末端組織的病理學(xué)檢查 進(jìn)腹后，肉眼觀察胰腺及腹腔各臟器的大體變化情況。HE染色：將胰腺和回腸末端組織用甲醛固定，制備石蠟標(biāo)本，常規(guī)進(jìn)行HE染色，觀察胰腺和回腸末端組織的病理學(xué)變化。

1.2.5胰腺組織和腸黏膜組織病理評(píng)分 胰腺組織根據(jù)水腫、壞死、出血及炎癥細(xì)胞浸潤情況評(píng)價(jià)病理損傷程度，每項(xiàng)分值為0～4分，各項(xiàng)分值總和為病理評(píng)分；腸黏膜病理評(píng)分：根據(jù)腸黏膜損傷評(píng)分方法對腸黏膜進(jìn)行病理評(píng)分，腸黏膜絨毛正常為0分；絨毛頂端上皮下出現(xiàn)間隙伴毛細(xì)血管充血為1分；上皮下間隙擴(kuò)大、固有層重度水腫、乳糜管擴(kuò)張為2分；腸黏膜上皮層細(xì)胞變性壞死、固有層水腫明顯為3分；上皮細(xì)胞層變性壞死、毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，固有層裸露為4分；固有層崩解、絨毛脫落為5分。

1.2.6血內(nèi)毒素、淀粉酶、瘦素水平測定 采用改良鱟實(shí)驗(yàn)方法測定血內(nèi)毒素水平；采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清淀粉酶水平；采用放射免疫法測定血清瘦素水平。

1.2.7血清sIgA、MBL、IL-4水平測定 采用放射免疫法測定血清sIgA水平；采用ELISA法測定血清MBL和IL-4水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠術(shù)后情況 術(shù)后假手術(shù)組大鼠無死亡，狀態(tài)良好，肌力正常，活動(dòng)敏捷；胰腺炎組大鼠2只死亡，一般狀態(tài)差，飲水進(jìn)食差，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍；甘露糖組大鼠1只死亡，一般狀態(tài)尚可，飲水進(jìn)食較胰腺炎組好，反應(yīng)較胰腺炎組敏捷。

2.2三組大鼠大體病理變化 假手術(shù)組大鼠腹腔內(nèi)器官正常，無腹水；胰腺炎組大鼠胃腸脹氣比較明顯，見大量淡黃色或淡紅色腹水，胰腺呈暗紅色，大片出血壞死，見皂化斑；甘露糖組大鼠胃腸脹氣較胰腺炎組輕，胰腺呈暗紅色，見片狀出血壞死，偶見皂化斑。

2.3三組大鼠胰腺組織HE染色 術(shù)后12 h，假手術(shù)組大鼠見散在水腫細(xì)胞，偶見出血壞死，無炎癥細(xì)胞浸潤；胰腺炎組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)彌漫性水腫，胰腺腺泡細(xì)胞較多壞死，見片狀出血灶，有大量炎癥細(xì)胞浸潤；甘露糖組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)比較清晰，見區(qū)域性水腫，少量出血灶和壞死細(xì)胞，少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 三組大鼠胰腺組織HE染色(×200)

2.4三組大鼠腸黏膜HE染色 假手術(shù)組大鼠腸黏膜絨毛和上皮形態(tài)完整，未見明顯損傷；胰腺炎組大鼠腸黏膜固有層水腫，絨毛頂端脫落，形態(tài)不規(guī)則，腸黏膜上皮細(xì)胞壞死；甘露糖組大鼠腸黏膜固有層水腫較胰腺炎組輕，絨毛形態(tài)不規(guī)則和上皮細(xì)胞壞死較胰腺炎組輕。見圖2。

圖2 三組大鼠腸黏膜HE染色(×200)

2.5三組大鼠胰腺病理學(xué)評(píng)分和腸黏膜病理學(xué)評(píng)分比較 三組大鼠胰腺病理學(xué)評(píng)分和腸黏膜病理學(xué)評(píng)分比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中胰腺炎組和甘露糖組大鼠胰腺病理學(xué)評(píng)分和腸黏膜病理學(xué)評(píng)分均高于假手術(shù)組(P<0.05)，甘露糖組大鼠胰腺病理學(xué)評(píng)分和腸黏膜病理學(xué)評(píng)分低于胰腺炎組(P<0.05)。見表1。

2.6三組大鼠血清內(nèi)毒素、淀粉酶、瘦素水平比較 三組大鼠血清內(nèi)毒素、淀粉酶、瘦素水平比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中胰腺炎組和甘露糖組血清內(nèi)毒素、淀粉酶、瘦素水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)，甘露糖組大鼠血清內(nèi)毒素、淀粉酶、瘦素水平低于胰腺炎組(P<0.05)。見表2。

表1 三組胰腺病理學(xué)評(píng)分和腸黏膜病理學(xué)評(píng)分比較分)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05;與胰腺炎組比較:2)P<0.05；下表同

表2 三組大鼠血清內(nèi)毒素、淀粉酶、瘦素水平比較

2.7三組大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比較 三組大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中胰腺炎組和甘露糖組血清sIgA、IL-4水平均低于假手術(shù)組(P<0.05)，甘露糖組血清sIgA、IL-4水平高于胰腺炎組；胰腺炎組和甘露糖組血清MBL水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)，甘露糖組血清MBL水平高于胰腺炎組(P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比較

3 討 論

重癥急性胰腺炎時(shí)多種原因均可引起腸黏膜屏障功能障礙，引起腸道內(nèi)細(xì)菌移位，腸道內(nèi)的內(nèi)毒素和細(xì)菌進(jìn)入血液循環(huán)后激活單核-巨噬細(xì)胞，釋放大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生。重癥急性胰腺炎患者幾乎都有不同程度的腸黏膜屏障功能障礙，隨著病情的進(jìn)展，可對腸道造成不可逆損傷，腸黏膜屏障功能障礙使腸道通透性增加，腸道內(nèi)的內(nèi)毒素和細(xì)菌穿過腸黏膜，浸入腸壁、門靜脈、腸系膜淋巴結(jié)等部位，發(fā)生細(xì)菌易位〔5～7〕。重癥急性胰腺炎時(shí)革蘭陰性菌數(shù)量增加，附著在腸壁，釋放大量內(nèi)毒素，引起腸道屏障損傷〔8,9〕。瘦素具有廣泛的生物學(xué)作用，胰腺組織中存在有瘦素受體，在急性胰腺炎中瘦素發(fā)揮重要作用，胰腺炎患者瘦素水平升高〔10,11〕。sIgA水平代表局部體液免疫功能，是黏膜局部免疫反應(yīng)的主要抗體。sIgA主要在黏膜上層黏液中存在，和肝膽疾病、呼吸道疾病、消化道疾病、泌尿生殖道疾病等多種疾病有關(guān)。在腸道內(nèi)，sIgA能夠抵抗蛋白水解，參與消化道黏膜防御作用，sIgA水平下降表示局部免疫功能下降〔12,13〕。MBL由肝臟合成，為一種急性期蛋白，對吞噬和炎癥具有調(diào)節(jié)作用，和多種感染性疾病、自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)〔14,15〕。IL-4為細(xì)胞因子之一，可以增加sIgA的分泌，增加機(jī)體體液免疫功能。在腸道組織中IL-4來自腸道固有層，可以抑制炎性細(xì)胞活化，減少炎癥因子釋放，從而發(fā)揮抗炎作用〔16〕。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)：重癥急性胰腺炎大鼠胰腺出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，腸黏膜組織受到破壞，血清內(nèi)毒素、淀粉酶、瘦素、MBL水平升高，血清sIgA、IL-4水平下降?？梢?，重癥急性胰腺炎大鼠模型存在腸黏膜屏障功能障礙。

甘露糖是一種六碳糖，在糖代謝過程中磷酸化生成甘露糖-6-磷酸，是臨床上唯一應(yīng)用的糖質(zhì)營養(yǎng)素，在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，在腸、肝、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等部位均有分布，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，抵抗細(xì)菌感染、抑制巨噬細(xì)胞炎癥、促進(jìn)傷口愈合而發(fā)揮抗炎作用。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘露糖可以減輕重癥急性胰腺炎大鼠胰腺炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸黏膜免疫屏障，其保護(hù)作用可能和甘露糖刺激肝臟分泌MBL，從而增加sIgA、IL-4水平有關(guān)。