丁苯酞聯(lián)合甘露醇對(duì)彌漫性腦損傷大鼠咬合蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的影響

劉俊杰 趙宏濤 馮思國 王婧瑤 梁文吉 王一超 李建民 趙雅寧 徐繼偉

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

彌漫性腦損傷(DBI)具有較高致死率，主要死因?yàn)閯?chuàng)傷后廣泛性腦水腫，急性的腦水腫導(dǎo)致腦組織體積增大，顱內(nèi)壓增高，甚至引起腦疝，是急性DBI后致死的主要原因〔1〕。目前臨床主要使用甘露醇行脫水治療來降低顱內(nèi)壓，但有研究報(bào)道大劑量應(yīng)用甘露醇會(huì)導(dǎo)致腎衰竭等〔2〕。丁苯酞是我國自行研制的擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國家一類新藥，可通過提高腦血管內(nèi)皮一氧化氮(NO)和前列腺素(PG)I2的水平〔3〕，降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度、抑制谷氨酸釋放及降低花生四烯酸的含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等機(jī)制阻斷急性腦損傷的多個(gè)病理環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮較強(qiáng)的抗腦缺血作用，丁苯酞聯(lián)合甘露醇對(duì)腦損傷的治療國內(nèi)鮮有報(bào)道。咬合蛋白是腦微血管緊密連接的主要成分，與腦水腫形成的關(guān)系密切〔4〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9是一種水解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白裂解酶〔5〕，可攻擊腦血管外基膜的層黏蛋白和纖黏蛋白，破壞血腦屏障，也與腦水腫形成密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察丁苯酞與甘露醇聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DBI腦水腫及咬合蛋白、MMP-9表達(dá)的影響，旨在探討丁苯酞對(duì)彌漫性腦損傷大鼠的腦保護(hù)機(jī)制及丁苯酞與甘露醇合用的效果。

1 材料與方法

1.1材料與分組 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠240只，平均體重(300±20)g，購自北京維通利華公司〔合格證：SCXK(京)2002-003〕，飼養(yǎng)于河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水。動(dòng)物房每天光暗交替，相對(duì)濕度55%，溫度22℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循國際生命指導(dǎo)中心和使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則。按隨機(jī)數(shù)字法分為模型組(n=80)，甘露醇組(n=80)，丁苯酞+甘露醇組(n=80)。每組又根據(jù)3 h、12 h、24 h、72 h、144 h分成5個(gè)亞組。

1.2DBI模型的建立 參考Marmarou等〔6〕的自由落體打擊大鼠法制作創(chuàng)傷性腦損傷模型：術(shù)前12 h大鼠禁食水，乙醚麻醉70～150 s，將麻醉好的大鼠俯臥于固定的海綿床墊(10 cm×20 cm×30 cm)上，用一直徑1.9 cm、質(zhì)量為450 g 的銅制圓柱從1.5 m高度垂直落下撞擊大鼠顱骨冠狀縫與矢狀縫交點(diǎn)處的不銹鋼墊，制造DBI大鼠模型。

1.3給藥方法 甘露醇組和丁苯酞+甘露醇組大鼠腹股溝區(qū)消毒備皮，在嚴(yán)格無菌的條件下，在下肢根部作一與腹股溝平行的切口，找到股靜脈。在顯微鏡下以1 ml注射器穿刺股靜脈，造模成功后10 min按1.0 g/kg體重靜注甘露醇。靜注完畢后縫合切口。丁苯酞+甘露醇組在大鼠致傷后10 min 給予丁苯酞軟膠囊植物油溶液(0.1 g/ml) 0.4 ml/kg灌胃，1次/d，直至各時(shí)間點(diǎn)處死。模型組及甘露醇組在相同時(shí)間內(nèi)給予等量植物油0.4 ml/kg。

1.4腦組織含水量測定 隨機(jī)選取3組模型中各時(shí)間點(diǎn)大鼠各5只，用10%水合氯醛深度麻醉后，處死取腦，取200 mg左右損傷灶周圍腦組織，應(yīng)用MA110電子分析天平(上海第二天平儀器廠)稱取腦組織濕重并且記錄后將組織放置于105℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥48 h至恒重，稱其干重后按Elliot公式計(jì)算腦含水量：腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5腦血管通透性測定 隨機(jī)選取3組模型各時(shí)間點(diǎn)大鼠4只，制作伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此測定腦組織的伊文思藍(lán)含量(μg/g濕重腦組織)。方法：從尾靜脈以2 ml/kg的量注入2%伊文思藍(lán)，2 h后10%水合氯醛麻醉、采用生理鹽水心內(nèi)灌注后斷頭取腦，稱取雙側(cè)大腦皮質(zhì)濕重后置于甲酰胺(1 ml/100 g腦組織)中，60℃溫水孵育24 h。1 000 r/min離心機(jī)上離心5 min，采用分光光度計(jì)(λ=632 nm)測定上清液吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出伊文思藍(lán)含量。

1.6免疫組織化學(xué)檢測腦組織咬合蛋白及MMP-9的表達(dá) 隨機(jī)選取3組各時(shí)間點(diǎn)大鼠各5只，10%水合氯醛深度麻醉后開胸，4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液中4℃冰箱過夜至組織塊沉底，冠狀位切取2 mm組織塊，浸于4%多聚甲醛再固定4 h。切片經(jīng)流水沖洗，脫水透明，石蠟包埋。連續(xù)切片，片厚5 μm。取各大鼠同部位切片3張，脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10 min，高壓熱修復(fù)，滴加咬合蛋白一抗(1∶100，美國Santa Cruz 生物技術(shù)公司)4℃過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶2 000，武漢博士德生物工程有限公司)，37℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.7Western印跡檢測腦損傷周圍皮層咬合蛋白和MMP-9表達(dá)的變化 大鼠處死后，冰上迅速取腦，使用細(xì)胞裂解液分別提取各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠損傷區(qū)周圍腦組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，上樣量為100 μg。15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，硝酸纖維素(NC)轉(zhuǎn)膜，再經(jīng)5%脫脂奶粉封閉; 山羊抗咬合蛋白多克隆一抗(1∶1 000倍稀釋) 、山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶1 000倍稀釋)、山羊抗 actin多克隆一抗(1∶1 000倍稀釋)，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000倍稀釋) 室溫孵育。電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行定量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織含水量和伊文思藍(lán)含量比較 甘露醇組腦組織含水量較模型組明顯下降(P<0.05)。丁苯酞+甘露醇組腦組織含水量較甘露醇組明顯下降(P<0.05)。其中3 h腦組織含水量開始增加，12 h繼續(xù)增加，24 h達(dá)到高峰，72 h腦組織含水量開始下降，144 h腦組織含水量明顯下降。甘露醇組血管通透性較模型組明顯降低(P<0.05)，丁苯酞+甘露醇組血管通透性較甘露醇組明顯降低(P<0.05)。其中3 h血管通透性開始增加，12 h繼續(xù)增加，24 h達(dá)到高峰，72 h開始下降，144 h明顯下降。見表1、表2。

表1 各組腦組織含水量比較

與模型組比較：1)P<0.05；與甘露醇組比較：2)P<0.05；與本組前一時(shí)間點(diǎn)比較：3)P<0.05，下表同

表2 各組皮質(zhì)區(qū)伊文思藍(lán)含量比較

2.2各組腦組織MMP-9免疫組化結(jié)果比較 模型組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)周圍都可見大量被染成棕黃色的陽性細(xì)胞，包膜表達(dá)，甘露醇組陽性細(xì)胞數(shù)在3 h、12 h較模型組有明顯減少(P<0.05)，而在24 h、72 h、144 h無明顯差異(P>0.05);丁苯酞+甘露醇組陽性細(xì)胞較甘露醇組明顯減少(P<0.05)。其中傷后3 h MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)開始加，24 h達(dá)高峰，72 h開始減少，144 h明顯減少。見表3。

表3 各組腦組織MMP-9免疫組化結(jié)果比較

2.3各組腦組織咬合蛋白免疫組化結(jié)果比較 模型組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)域周圍可見少量被染成棕黃色的陽性細(xì)胞，細(xì)胞核表達(dá)。與模型組相比，甘露醇組大鼠損傷區(qū)周圍陽性細(xì)胞數(shù)在傷后3 h明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在傷后12 h、24 h、72 h、144 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與甘露醇組相比，丁苯酞+甘露醇組損傷區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白陽性細(xì)胞開始減少，24 h減少最為明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見表4。

表4 各組腦組織咬合蛋白免疫組化結(jié)果比較

2.4各組腦組織MMP-9 Western印跡結(jié)果比較 與模型組大鼠相比，甘露醇組在傷后3 h、12 h損傷區(qū)域MMP-9的含量明顯減少(P<0.05)，而在傷后24 h、72 h、144 h無明顯差異(P>0.05)；與甘露醇組相比，丁苯酞+甘露醇組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)域MMP-9的含量明顯減少(P<0.05)。其中傷后3 h MMP-9含量開始增加，24 h減增加最明顯，72 h開始減少，144 h明顯減少。見表5。

表5 各組腦組織MMP-9 Western印跡結(jié)果比較

2.5各組腦組織咬合蛋白Western印跡結(jié)果比較 與模型組相比，甘露醇組在傷后3 h損傷區(qū)咬合蛋白含量明顯增多(P<0.05)，其他時(shí)相沒有明顯差別(P>0.05)；與甘露醇組相比，丁苯酞+甘露醇組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)域咬合蛋白含量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白含量開始減少，24 h減少最為明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見表6。

表6 各組腦組織咬合蛋白Western印跡結(jié)果比較

3 討 論

腦水腫是顱腦損傷后主要繼發(fā)性病理過程，也是其主要的致死因素。DBI可引起局部腦組織微循環(huán)障礙，缺血缺氧，甚至引起炎癥反應(yīng)、自由基損傷、血腦屏障通透性增高等病理過程，導(dǎo)致腦水腫形成〔7〕。腦水腫形成后可進(jìn)一步加重腦組織缺血缺氧，并且可引起顱內(nèi)壓增高，甚至腦疝形成，明顯加重患者癥狀，影響患者預(yù)后〔8〕。目前臨床上常用甘露醇等高滲性脫水劑治療腦水腫，其作用機(jī)制是①快速擴(kuò)充血容量，降低血細(xì)胞比容和血液黏度，改善血液流變學(xué)，增加腦血流量和氧傳遞，使顱內(nèi)壓在幾分鐘內(nèi)降低；②滲透壓效應(yīng)：通過滲透性脫水作用減少腦組織的含水量；③腦血管作用：在腦血流自動(dòng)調(diào)節(jié)正常情況下，增加氧輸送可以使局部腦組織中血管收縮；④可能具有清除自由基的作用〔9〕。本研究結(jié)果與此一致。Rafols等〔10〕研究結(jié)果顯示，腦損傷后12～48 h腦血流減少近三分之一。丁苯酞可通過提高腦血管內(nèi)皮NO和PGI2的水平，降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，抑制谷氨酸釋放，降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等機(jī)制阻斷急性腦損傷的多個(gè)病理環(huán)節(jié)，具有改善微循環(huán)的作用〔11〕。我們推測，丁苯酞正是通過該機(jī)制減輕腦水腫，因此丁苯酞聯(lián)合甘露醇較單純應(yīng)用甘露醇的效果要好。

MMP-9主要存在于腦組織的海馬、皮質(zhì)和紋狀體中，但正常情況下含量很少〔12〕。本研究結(jié)果顯示，傷后3 h損傷區(qū)皮層MMP-9表達(dá)開始增加，24 h達(dá)到高峰，72 h開始降低，144 h明顯降低，與Lucivero等〔13〕的研究基本一致。甘露醇組在損傷早期較模型組損傷區(qū)周圍皮質(zhì)MMP-9含量有所下降，谷月〔2〕的研究顯示，甘露醇只是高滲性脫水，并未直接影響MMP-9的代謝，脫水的速度可能會(huì)對(duì)MMP-9的含量產(chǎn)生影響。本文結(jié)果提示丁苯酞可減少損傷灶周圍皮層MMP-9的表達(dá)。鄢學(xué)芬等〔14〕研究表明，丁苯酞具有減少損傷灶周圍中性粒細(xì)胞數(shù)目、抑制白細(xì)胞介素(IL)-1和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)的作用，而中性粒細(xì)胞是腦梗死后MMP-9的主要來源，而且MMPs的基因表達(dá)受IL-1等細(xì)胞因子的調(diào)控。我們推測丁苯酞可通過抑制該炎癥反應(yīng)過程，從而減少M(fèi)MP-9的表達(dá)。而甘露醇并不能抑制該炎癥反應(yīng)過程。因此，丁苯酞聯(lián)合甘露醇治療要比單純甘露醇治療MMP-9的表達(dá)少。

咬合蛋白是血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的重要組成部分，DBI患者咬合蛋白的表達(dá)明顯減少，因此血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接破壞，血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，腦水腫形成〔15〕。本研究結(jié)果顯示，傷后3 h損傷去皮層區(qū)咬合蛋白表達(dá)開始減少，24 h達(dá)到最低，72 h開始回升，144 h明顯回升。甘露醇組BDI大鼠模型損傷區(qū)域周圍皮層咬合蛋白的含量在傷后3 h較模型組高，其他時(shí)相均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其機(jī)制尚不明確，國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。我們推測，咬合蛋白的含量可能也與脫水的速度有關(guān)。丁苯酞聯(lián)合甘露醇治療DBI大鼠模型損傷區(qū)域周圍皮層咬合蛋白的含量明顯高于甘露醇治療組。Gidday等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)MMP-9可降解緊密連接中的咬合蛋白，從而破壞血腦屏障的功能，導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生。Seth等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可通過調(diào)節(jié)咬合蛋白的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸的磷酸化狀態(tài)，來調(diào)節(jié)緊密連接的開合，進(jìn)而影響血腦屏障的通透性。有學(xué)者研究〔18〕，顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，鈣通道大量開放，鈣離子大量內(nèi)流，進(jìn)而通過咬合蛋白的調(diào)節(jié)破壞血腦屏障的通透性，加重腦水腫。我們推測丁苯酞可通過降低MMP-9的表達(dá)來減少對(duì)咬合蛋白的降解，或者通過減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度來調(diào)節(jié)咬合蛋白的表達(dá)，減少對(duì)血腦屏障的破壞，進(jìn)而減輕腦水腫的程度。因此，丁苯酞聯(lián)合甘露醇組要比單純甘露醇治療腦水腫的程度要輕。