補腎方與補腎健脾方對快速老化模型小鼠腸和骨堿性磷酸酶蛋白的影響

張瀾川 李 然 劉立萍

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110032)

骨質(zhì)疏松(OP)是一種與年齡密切相關(guān)的疾病，SAMP6快速老化小鼠是一種研究老年性骨質(zhì)疏松(SOP)理想的動物模型，股骨及其他組織的病理改變與老年病理狀態(tài)相似，可將其應(yīng)用于SOP等老年性疾病的基礎(chǔ)研究。腸鈣吸收減少是SOP發(fā)生的重要因素之一〔1〕，十二指腸是參與腸鈣吸收的主要場所〔2〕，十二指腸腸黏膜屏障功能的維護與腸堿性磷酸酶(ALP)密切相關(guān)。前期研究結(jié)果表明左歸丸含藥血清對成骨細(xì)胞(OB)增殖具有促進作用，并提高OB的ALP活性〔3〕。本研究擬分析補腎方與補腎健脾方對SAMP6快速老化模型小鼠十二指腸組織與股骨組織ALP蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取3月齡SPF級雄性未交配SAMP6快速老化模型小鼠24只，SAMR1同源對照小鼠8只，體重(30±2)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。

1.2主要藥物與試劑 補腎方左歸丸組成：熟地黃24 g，炒山藥、枸杞子、山茱萸、龜板膠、鹿角膠、菟絲子各12 g，川牛膝9 g。補腎健脾方左歸丸合苓桂術(shù)甘湯組成：熟地黃24 g，炒山藥、枸杞子、山茱萸、龜板膠、鹿角膠、菟絲子各12 g，川牛膝9 g，茯苓20 g，桂枝15 g，白術(shù)15 g，炙甘草10 g，均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，制備水煎劑。購自abcam公司的抗ALP抗體、博奧森公司的抗Ⅰ型膠原(Col1)抗體、Santa Cruz公司的抗β-Actin抗體。

1.3主要儀器 德國Leica石蠟切片機，日本OLYMPUS顯微鏡，美國Bio-Rad公司Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Protein Simple公司FluorChem Q蛋白質(zhì)印跡成像系統(tǒng)。

1.4方法

1.4.1動物分組 實驗分為SAMR1(對照組)、SAMP6(模型組)、補腎方和補腎健脾方4組各8只。

1.4.2給藥與取材 補腎方與補腎健脾方給藥劑量根據(jù)人與小鼠體表面積等效劑量折算，SAMR1與SAMP6給予等量水，1次/d，連續(xù)給藥12 w，收集各組小鼠十二指腸組織和股骨組織。

1.4.3指標(biāo)檢測 采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察各組小鼠十二指腸組織形態(tài)，光學(xué)顯微鏡下觀察和采集圖像；采用Masson染色法，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨組織膠原形態(tài)和采集圖像，Masson染色膠原纖維呈藍(lán)色；采用Western印跡法檢測股骨組織Col1蛋白表達(dá)水平；采用免疫組織化學(xué)(SABC) 染色法，光學(xué)顯微鏡下觀察十二指腸與股骨組織ALP蛋白表達(dá)，SABC染色呈棕色至棕黃色染色區(qū)域為陽性表達(dá)區(qū)域。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1補腎方與補腎健脾方對SAMP6小鼠十二指腸組織形態(tài)的影響 對照組十二指腸組織小腸絨毛形成明顯的葉狀突起，表面上皮細(xì)胞完整，黏膜層形態(tài)完好，腺體較為完整，可見清晰的杯狀細(xì)胞。與對照組比較，模型組十二指腸組織小腸絨毛形成的葉狀突起破壞，腸絨毛縮短，表面上皮細(xì)胞受損，腸腺排列紊亂。與模型組比較，給藥組小腸絨毛形成的葉狀突起較為明顯，腸腺排列較整齊，無明顯細(xì)胞損傷。見圖1。

圖1 各組十二指腸組織形態(tài)(HE，×200)

2.2補腎方與補腎健脾方對SAMP6小鼠股骨組織膠原的影響 對照組骨小梁形態(tài)完整，股骨組織膠原面積染色較均一；與對照組比較，模型組骨小梁染色面積減少，膠原染色色淡且不均一；與模型組比較，給藥組骨小梁染色面積均增加，骨小梁著色較均一，有少處著色不均，骨膠原含量明顯增加。見圖2。

圖2 各組股骨組織膠原情況(Masson染色，×200)

2.3補腎方與補腎健脾方對SAMP6小鼠股骨組織Col1蛋白表達(dá)的影響 與對照組(0.94±0.06)比較，模型組股骨組織Col1蛋白表達(dá)(0.81±0.04)明顯下調(diào)(P<0.05)，與模型組比較，補腎方組(0.91±0.04)與補腎健脾方組(0.93±0.02)顯著上調(diào)股骨組織Col1蛋白表達(dá)(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組股骨組織Col1蛋白表達(dá)

2.4補腎方與補腎健脾方對SAMP6小鼠十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)的影響 對照組十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)較多，陽性表達(dá)區(qū)域廣泛，主要分布于柱狀上皮細(xì)胞及腸腺細(xì)胞的胞質(zhì)中。與對照組比較，模型組十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)減少，陽性表達(dá)區(qū)域較小，腸上皮柱狀上皮細(xì)胞損傷。與模型組比較，給藥組可增加十二指腸ALP蛋白表達(dá)，陽性表達(dá)區(qū)域明顯增加，給藥組對ALP蛋白表達(dá)有較為明顯的影響。見圖4。

圖4 各組十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.5補腎方與補腎健脾方對SAMP6小鼠股骨組織ALP蛋白表達(dá)的影響 對照組股骨組織ALP蛋白表達(dá)較多，在骨髓細(xì)胞中ALP有較為明顯的表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。與對照組比較，模型組股骨組織骨小梁面積減少，骨髓腔面積增大，ALP蛋白表達(dá)明顯的減少，陽性表達(dá)區(qū)域較小。與模型組比較，給藥組可增加股骨組織ALP蛋白表達(dá)，陽性表達(dá)區(qū)域明顯增加，在骨髓腔中和骨小梁骨細(xì)胞中均可見表達(dá)。見圖5。

圖5 各組股骨組織ALP蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

3 討 論

SOP為低轉(zhuǎn)換型原發(fā)性O(shè)P，與年齡密切相關(guān)。隨年齡增長，伴隨骨代謝激素分泌的轉(zhuǎn)變與骨細(xì)胞功能下降〔4〕。SAMP6快速老化模型小鼠骨量減少，骨密度(BMD)降低，骨微結(jié)構(gòu)被破壞，骨脆性增加，并伴有OB骨形成低下與破骨細(xì)胞骨吸收增強等特點，是研究SOP的理想動物模型〔5〕。SAMP6快速老化模型小鼠較同源對照SAMR1小鼠出現(xiàn)明顯的骨礦含量升高及骨鈣素水平降低，股骨生物力學(xué)性能低下〔6〕。本研究結(jié)果顯示SAMP6快速老化模型小鼠股骨組織出現(xiàn)老化所致的骨小梁面積減少和骨髓腔增大等病理改變。

OP屬中醫(yī)“骨痿”和“骨痹”范疇，《素問·五臟生成篇》云：“腎之合骨也，其榮發(fā)也，其主脾也?！敝嗅t(yī)防治原發(fā)性O(shè)P，多以補腎為主，健脾為輔〔7〕。本研究結(jié)果顯示補腎方與補腎健脾方可有效改善SAMP6快速老化模型小鼠股骨組織的病理改變。

導(dǎo)致OP發(fā)病的重要原因之一是小腸對鈣離子吸收作用的下降，十二指腸是鈣離子吸收的主要部位〔8〕。有研究表明衰老過程中，腸黏膜絨毛出現(xiàn)萎縮，隱窩變淺，腸黏膜完整性被破壞，小腸的消化、吸收、防御等正常生理功能呈現(xiàn)下降的趨勢〔9〕。補腎中藥可增強腸鈣吸收功能〔10〕。本研究結(jié)果提示補腎方與補腎健脾方可有效改善衰老所致的腸上皮細(xì)胞損傷。Col1廣泛存在于骨基質(zhì)中，參與骨礦化過程和維持骨骼完整，在骨細(xì)胞形成與分化中起到重要作用〔11〕。前期研究結(jié)果表明補腎填精方左歸丸可上調(diào)去卵巢大鼠股骨組織Col1蛋白表達(dá)〔12〕。本研究結(jié)果提示補腎方與補腎健脾方可能通過增加骨膠原含量，促進骨形成，改善SAMP6快速老化模型小鼠的OP病理狀態(tài)。ALP廣泛存在于人體各臟器組織中，包括肝臟、腎臟、骨骼、腸和胎盤組織中。老年女性多見ALP活性下降，可能與絕經(jīng)后雌激素分泌減少有關(guān)，影響骨質(zhì)的再吸收〔13〕。不同組織亞型的ALP有各自的特性，但所有的ALP都可以使底物去磷酸化。ALP的功能為參與骨骼的鈣化及去鈣化，腸ALP對維持腸道穩(wěn)態(tài)有一定的作用〔14〕。ALP是骨形成和OB分化的標(biāo)志〔15〕，SOP患者血清ALP升高，BMD與ALP呈負(fù)相關(guān)〔16〕。補腎法與補腎健脾法均可有效改善原發(fā)性O(shè)P患者成骨過程，降低血清ALP水平〔17，18〕。腸ALP是一種錨定于腸上皮細(xì)胞頂膜上的糖蛋白，在腸黏膜屏障的維護中發(fā)揮著重要作用〔19〕。腸黏膜屏障功能受損與臨床多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，腸屏障功能障礙機制的研究對于臨床相關(guān)疾病的防治有重要意義〔20〕。本研究結(jié)果提示骨形成能力低下，腸黏膜屏障功能受損，SOP的發(fā)生發(fā)展可能與腸黏膜屏障功能紊亂密切相關(guān)；補腎方與補腎健脾方可有效調(diào)節(jié)十二指腸和股骨組織中ALP蛋白表達(dá)，提高OB活性，促進骨形成。

綜上，補腎方與補腎健脾方可有效改善SAMP6快速老化模型小鼠股骨組織骨小梁形態(tài)，增加股骨組織膠原含量和上調(diào)Col1蛋白表達(dá)，對SOP具有一定的防治作用；可改善SAMP6快速老化模型小鼠十二指腸組織腸黏膜損傷，上調(diào)十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)。補腎方與補腎健脾方可能是通過保護腸黏膜組織，改善SAMP6快速老化模型小鼠OB功能，防治SOP。