2型糖尿病大鼠腎組織NF-κB水平的變化

江思瑜 孫 霓 李金航 吳曉光

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

糖尿病(DM)腎病(DN)具有起病隱襲、進(jìn)展緩慢、高致殘致死率的特點(diǎn)，是發(fā)達(dá)國家慢性腎衰的首位病因〔1〕。目前已發(fā)現(xiàn)高血壓、血液改變、氧化應(yīng)激、炎癥機(jī)制等參與了DN的形成，但對于DN發(fā)病的確切機(jī)制尚不完全清楚〔2〕。核因子(NF)-κB作為主要的轉(zhuǎn)錄因子之一，具有多向性，參與機(jī)體多種生理調(diào)節(jié)，如：細(xì)胞的增殖與凋亡、炎癥、免疫等〔3〕。本研究旨在探究NF-κB在DN形成中所扮演的作用。

1 材料與方法

1.1材料 100只健康SD大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，高脂高糖飼料(北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)，兔抗鼠p50單克隆抗體(Santa Cruz公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒與SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2動(dòng)物建模及分組 運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將100只SD大鼠分為正常組(NC組)與DM組，各50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。NC組飼喂正常飲食，DM組飼喂高脂高糖飲食4 w后，禁食禁水24 h，按30 mg/kg腹腔注射經(jīng)緩沖液稀釋的STZ，48～72 h后，大鼠尾靜脈采血，連續(xù)3次所測空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，同時(shí)尿糖>()為模型建立成功準(zhǔn)則，NC組則注射等量溶媒。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 分別于建模成功后的2、4、8 w，稱量大鼠體重(BW)后處死。處死大鼠前24 h開始收集代謝籠中大鼠尿液，甲苯防腐，混勻充分，300 r/min離心，取上清液檢測24 h尿蛋白(UP)、尿糖。3.5%戊巴比妥麻醉下，于大鼠股靜脈收集血液標(biāo)本，300 r/min離心，取上清液分裝，全自動(dòng)生化儀檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血清白蛋白(ALB)水平。120 mmHg高壓下，4℃生理鹽水多次漂洗腎臟至蒼白，4%多聚甲醛溶液灌注，摘取腎臟，酒精梯度脫水，石蠟包埋，制作成厚度5 μm石蠟切片。石蠟切片依次二甲苯脫蠟、酒精脫水、蘇木精染色、鹽酸乙醇漂洗、酒精脫水、伊紅乙醇復(fù)染、酒精脫水、二甲苯透明進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腎臟病理變化。石蠟切片依次脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)、滴加兔抗鼠p50單克隆抗體為一抗(1∶50稀釋)過夜、滴加二抗、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)孵育、DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明。高倍鏡下，隨機(jī)選取每張切片陽性細(xì)胞表達(dá)區(qū)的5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)，取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0系統(tǒng)進(jìn)行t檢驗(yàn)、線性相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1各組生長指標(biāo)檢測結(jié)果 DM組2、4、8 w 24 h UP、FBG、BUN、SCr均較NC組顯著增高(P<0.05)，BW、血清ALB均較NC組顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組腎臟結(jié)構(gòu)變化比較 HE染色下，NC組各個(gè)時(shí)期腎臟結(jié)構(gòu)無明顯異常改變；DM組則均出現(xiàn)腎小球增大、基膜加厚、系膜擴(kuò)增等病理變化，且隨病程延長，病理變化愈加明顯，在第8周，腎臟可見炎細(xì)胞浸潤。見圖1。

表1 各組生化指標(biāo)檢測結(jié)果

與NC組相比:1)P<0.05

圖1 DM組腎臟改變(×400)

2.3SABC免疫組化法檢測NF-κB表達(dá) NF-κBp50在NC組各時(shí)期大鼠腎臟中表達(dá)較少，2、4、8 w腎臟細(xì)胞有NF-κBp50表達(dá)的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(1.26±0.74)、(1.58±1.23)、(1.47±1.03)個(gè)，且在胞質(zhì)表達(dá)多于胞核表達(dá)；NF-κBp50在DM組各時(shí)期腎臟內(nèi)均有陽性表達(dá)，并呈上升態(tài)勢，2、4、8 w腎臟細(xì)胞有NF-κBp50表達(dá)的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(10.57±4.77)、(23.99±7.76)、(32.36±5.87)個(gè)，較NC組顯著增多(P<0.05)。

2.4相關(guān)性分析 NF-κBp50在腎臟中的表達(dá)與24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)(r=0.852，P<0.05)，與BUN呈正相關(guān)(r=0.715，P<0.05)，與血清ALB呈負(fù)相關(guān)(r=-0.689，P<0.05)。

3 討 論

幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)都含有NF-κB〔4〕。NF-κB是一種調(diào)控基因表達(dá)的蛋白家族，由五個(gè)亞型組成，共同擁有Rel同源區(qū)，根據(jù)反式激活結(jié)構(gòu)域(TD)的有無分為兩類〔5〕，一類有TD類：Rel(cRel)、RelB、p65(RelA，NF-κB3)；另一類無TD類：p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。二元對稱是NF-κB序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，此特點(diǎn)決定了各個(gè)亞型必須發(fā)生二聚化，形成二聚體才可以發(fā)揮生物作用，最常見的二聚體是p50、p65二聚體〔6〕。當(dāng)無刺激產(chǎn)生時(shí)，細(xì)胞處于靜止，NF-κB的二聚體與NF-κB抑制因子(IκB)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合，處于無活性狀態(tài)〔7〕；當(dāng)受到外界刺激時(shí)，主要通過兩種方式活化NF-κB，(1)經(jīng)典途徑〔6，8〕：IkBs經(jīng)IkBs激酶(IKK)磷酸化自身兩個(gè)特殊絲氨酸殘基，隨后結(jié)合SCF-E3泛素化連接酶，泛素化的IkBs與NF-κB二聚體解離，對NF-κB的抑制作用喪失，NF-κB活化，進(jìn)入細(xì)胞核，與特定DNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄；(2)非經(jīng)典途徑〔6，9〕：p105、p100分別是p50、p52的前體物質(zhì)，除擁有p50、p52序列以外，還擁有IkB樣錨蛋白區(qū)，此區(qū)參與對相應(yīng)NF-κB的抑制，前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)閜50、p52的機(jī)制尚不完全清楚，但這一過程中IKK-a和NF-κB誘導(dǎo)激酶所發(fā)揮的作用不可忽視。

UP、BUN、血清ALB等均可作為反映腎功能強(qiáng)弱的指標(biāo)，推測NF-κBp50會對腎臟產(chǎn)生損害，并參與DN的致病。本文免疫組化結(jié)果與周誼霞等〔10〕結(jié)果相同。在李衍輝〔11〕的體外細(xì)胞培養(yǎng)研究中，同樣發(fā)現(xiàn)高糖腎系膜細(xì)胞對NF-κB表達(dá)的影響呈現(xiàn)濃度及時(shí)間的依賴性。高糖環(huán)境所致的代謝異?？梢哉T導(dǎo)多種信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激NF-κB激活因子生成，活化NF-κB表達(dá)〔12〕。以Toll樣受體(TLR)4信號通路為例，高糖激活TLR4，刺激髓樣細(xì)胞分化因子(MyD)88發(fā)生二聚化〔13〕，活化的TLR4結(jié)合MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域，同時(shí)MyD88的死亡結(jié)構(gòu)域活化IRAK家族，IRAK1經(jīng)IRAK4磷酸化后從MyD88上游離，轉(zhuǎn)向腫瘤壞死因子受體因子(TRAF)-6進(jìn)行結(jié)合，TRAF-6通過磷酸化IKK，激活NB-κB〔14，15〕。本研究結(jié)果提示NF-κB與DN病程關(guān)系緊密，這可能與持續(xù)的高糖環(huán)境刺激促使NF-κB活化因子生成增加，導(dǎo)致NF-κB表達(dá)增多有關(guān)。但也有學(xué)者〔11〕認(rèn)為是高糖環(huán)境通過對去泛素化酶CYLDN表達(dá)的抑制激活了NF-κB，NF-κB激活后刺激下游細(xì)胞黏附分子、炎性因子、趨化因子等細(xì)胞因子表達(dá)，這些因子通過不同途徑促進(jìn)腎臟內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、加重炎細(xì)胞聚集、調(diào)控凝溶之間的平衡等，最終造成微血管病變，形成DN。