電針對(duì)肥胖大鼠脂肪組織脂聯(lián)素與瘦素表達(dá)的影響

蘭彩蓮 潘曉華 萬(wàn) 隆 薩喆燕 黃倩茹 朱小香 蔡梅玉 許金森

(福建省中醫(yī)藥研究院 福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003)

肥胖癥容易引起糖尿病、心腦血管疾病和脂肪肝等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。研究〔1〕表明，電針具有較好的調(diào)脂作用，可改善機(jī)體代謝狀況，該療法副作用小且經(jīng)濟(jì)安全，有效降低血脂，并改善整體功能，患者接受度高。但針刺引起的代謝調(diào)節(jié)的效應(yīng)規(guī)律和作用機(jī)制研究尚存不足，尤其是從脂肪組織細(xì)胞因子角度方面。本研究以此為切入點(diǎn)，通過(guò)電針干預(yù)肥胖模型SD大鼠，觀察并比較電針前后SD大鼠脂肪組織中脂聯(lián)素(ADPN)和瘦素(LP)蛋白含量的變化，初步探討電針對(duì)SD大鼠脂肪組織細(xì)胞因子的影響，以期為肥胖癥的電針療法提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 ADPN和LP單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)。無(wú)菌針灸針(華成牌，規(guī)格0.18 mm×13 mm，生產(chǎn)批號(hào)：SD13A1105)，SDZ-Ⅱ型電針儀(華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，電泳儀(美國(guó)Bio-Red公司)，DW-86L626超低溫冰箱(海爾公司)，ALLEGRA 64R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)，回旋式脫色搖床(海門其林貝爾公司)，超靈敏全自動(dòng)多色熒光、化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Proteinsimple公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SD大鼠40只，體重(150±10)g ，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(閩)2016-0002(福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，飼養(yǎng)于本院動(dòng)物房(普通級(jí))，控制室內(nèi)溫度為25～28℃，相對(duì)濕度為50%～70%。本次實(shí)驗(yàn)全程中，動(dòng)物飼養(yǎng)條件依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布)。動(dòng)物處置方法依據(jù)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》(2006年科技部發(fā)布)。

1.3飼料配制 高脂飼料配方：普通飼料 67%、豬油 5%、麻油1%、奶粉 5%、蔗糖 5%、雞蛋 10%、花生 5%、食鹽 2%〔2〕，委托北京華阜康生物科技股份有限公司合成。

1.4動(dòng)物分組和模型建立 造模前隨機(jī)分為兩組，高脂飲食組給予高脂飼料飲食，另一組給予正常飲食。電針前高脂飲食組和正常飲食組分別按照隨機(jī)數(shù)字法分組，前者分為肥胖對(duì)照組和肥胖電針組，后者分為正常對(duì)照組和正常電針組，每組10只，控制環(huán)境溫度濕度，自由飲水。飼養(yǎng)8 w以上，以高脂飲食組體重增長(zhǎng)值超過(guò)正常飲食組10%且Lee指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義作為判斷造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5電針干預(yù) 肥胖電針組和正常電針組在造模結(jié)束后開(kāi)始電針干預(yù)，穴位選擇足三里穴(位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處，在脛腓骨間隙中)和內(nèi)庭穴(第2、3跖骨結(jié)合部前方凹陷處)〔3〕。無(wú)菌針灸針常規(guī)消毒，針刺得氣后，接華佗牌電針儀，電針參數(shù)：疏密波，頻率1.5檔(15 Hz)，強(qiáng)度約0.5檔(0.5～1 V)，以SD大鼠后肢輕微顫動(dòng)且不掙扎為度。1次/d，連續(xù)電針30 d；其余兩組每天同一時(shí)期同法束縛，不施加電針干預(yù)，1次/d，連續(xù)30 d。

1.7實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

1.7.1SD大鼠脂肪組織樣品收集 電針療程結(jié)束次日斷頭處死SD大鼠，迅速解剖分離腹腔脂肪組織，切取脂肪組織約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm大小，置于離心管中，存放于-80℃冰箱備測(cè)。

1.7.2脂肪組織ADPN和LP蛋白含量測(cè)定 取1 g脂肪組織，加入0.5 ml組織裂解液勻漿；10 000 r/min離心10 min，取上清；在上清中加入3倍體積的上樣緩沖液煮沸5 min；離心10 min，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)進(jìn)行蛋白檢測(cè)。取15 μl蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用4%積層膠、10%分離膠電泳。將膜放入牛血清白蛋白(BSA)封閉液室溫封閉1 h，合吐溫-20的Tris緩沖液(TBST)洗膜3次，每次5 min；加入大鼠ADPN、LP單克隆抗體1∶1 000稀釋，4℃孵育過(guò)夜，TBST搖床蕩洗3次，每次5 min。加入二抗及抗生物素抗體〔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記〕，室溫孵育膜1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入發(fā)光劑顯色2 min，曝光膠片，顯影定影掃描記錄(冰上進(jìn)行)。用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈吸光度值，與內(nèi)參抗體β-actin吸光度值相比，比值為檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1造模前后SD大鼠體重和體重增長(zhǎng)值比較 高脂飲食組與正常飲食組造模前體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模8 w后，20只高脂飲食大鼠中，淘汰體重增加不明顯的2只(造模失敗)，20只正常飲食組中，淘汰2只體重異常增加過(guò)多的大鼠(不合格對(duì)照)，故高脂飲食組與正常飲食組各18只納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示高脂飲食組體重增長(zhǎng)值平均比正常飲食組多約10%，高脂飲食組造模后體重、體重增長(zhǎng)值及Lee指數(shù)與正常飲食組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，顯示肥胖模型復(fù)制成功。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠脂肪組織ADPN和LP蛋白表達(dá)量的比較 肥胖電針組脂肪組織ADPN蛋白表達(dá)量(0.74±0.26)明顯上升，LP蛋白表達(dá)量(0.77±1.56)明顯下降，與肥胖對(duì)照組(0.50±0.17，1.73±0.73)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但對(duì)于正常飲食組，電針干預(yù)后，正常電針組(0.47±0.29，0.66±0.38)和正常對(duì)照組(0.46±0.22，0.75±0.16)ADPN和LP蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 造模前后SD大鼠體重、體重增長(zhǎng)值及Lee指數(shù)比較

與正常飲食組相比：1)P<0.05

3 討 論

ADPN是脂肪細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，參與了體內(nèi)的糖脂和內(nèi)分泌代謝，可能機(jī)制為借助激活特定信號(hào)途徑，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ、PPAR-α和腺嘌呤核糖核苷酸依賴的蛋白激酶(AMPK)等，通過(guò)抑制肝糖原異生、促進(jìn)肝臟脂肪酸氧化、促進(jìn)骨骼肌脂肪酸氧化及刺激攝入葡萄糖和分泌胰島素等反饋提高機(jī)體胰島素敏感性〔4〕。目前關(guān)于ADPN相關(guān)信號(hào)通路的具體研究較少，特別是從中醫(yī)角度,筆者推測(cè)針刺效應(yīng)改變能量代謝的作用機(jī)制中包含ADPN參與的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的實(shí)現(xiàn)。

LP是一種能量平衡調(diào)節(jié)激素，可作為反映高脂血癥病程的一個(gè)指標(biāo)。LP主要通過(guò)抑制食物攝入和調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝起作用〔5,6〕。LP基因廣泛表達(dá)于各種脂肪組織，并以皮下表達(dá)量為最高〔7〕。研究證實(shí)LP能通過(guò)下丘腦特定基因抑制蛋白的合成和分泌，降低食欲，增加能耗，從而起到調(diào)節(jié)能量代謝和調(diào)脂的作用〔8〕。劉志誠(chéng)等〔9〕對(duì)大鼠檢測(cè)認(rèn)為針灸調(diào)整改善了體內(nèi)血清的LP水平。肥胖患者大多數(shù)血清LP水平高于正常值，即存在LP抵抗〔10～12〕。綜合上述學(xué)者研究，LP抵抗反饋影響體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝，通過(guò)不同途徑或機(jī)制導(dǎo)致了肥胖等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。因此筆者認(rèn)為在肥胖的臨床治療中可針對(duì)LP抵抗采取干預(yù)措施，有望成為改善肥胖癥狀的切入點(diǎn)。

針灸作為一種綠色，經(jīng)濟(jì)，副作用小的自然療法，大眾可接受性高，對(duì)肥胖癥有一定改善作用，筆者推測(cè)針刺通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等體內(nèi)代謝過(guò)程發(fā)揮作用，在此過(guò)程中，LP抵抗及其他脂肪細(xì)胞因子可能發(fā)揮重要作用，影響一系列能量和物質(zhì)轉(zhuǎn)換機(jī)制，其間的聯(lián)系值得深入探索。楊春壯等〔13，14〕研究推測(cè)肥胖者LP過(guò)多分泌的改善可能是針刺減肥作用機(jī)制之一。但針刺效應(yīng)究竟是作用于肥大的脂肪細(xì)胞使體脂量下降而導(dǎo)致LP、胰島素抵抗水平的變化，還是機(jī)體對(duì)LP敏感性提高、興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)脂肪組織的分解、產(chǎn)熱增加而發(fā)揮降脂作用，抑或是影響了更復(fù)雜的脂肪-胰島內(nèi)分泌軸的功能活動(dòng)，或者通過(guò)下丘腦激活A(yù)MPK通路發(fā)揮作用，這一切還有待深入研究〔15〕。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肥胖與胃經(jīng)有著非常密切的聯(lián)系，脾胃為氣血生化之源，胃強(qiáng)脾弱是肥胖的發(fā)病基礎(chǔ)，肥胖癥初發(fā)病時(shí)或青少年型肥胖大多數(shù)為胃腸實(shí)熱型。綜合傳統(tǒng)中醫(yī)理論、既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，胃經(jīng)可能通過(guò)抑制中樞食欲，增加機(jī)體產(chǎn)熱及抑制血脂和體脂合成等方面對(duì)機(jī)體代謝改變產(chǎn)生影響。本研究取穴為足三里和內(nèi)庭，均屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，能夠清瀉胃熱，抑制食欲亢奮，可達(dá)到減肥降脂之功效。另有研究表明胃經(jīng)足三里和內(nèi)庭相配伍可調(diào)整肥胖機(jī)體內(nèi)分泌紊亂及能量代謝過(guò)程，抑制食欲亢進(jìn)的狀態(tài)，使失調(diào)紊亂的生理生化過(guò)程獲得調(diào)整，從而使體內(nèi)物質(zhì)代謝與能量代謝向正常水平轉(zhuǎn)化〔10〕。

本研究結(jié)果顯示針刺明顯增加了肥胖SD大鼠脂肪組織中的ADPN表達(dá)水平，并大幅度地抑制了LP蛋白的表達(dá)，改善了肥胖大鼠體內(nèi)的LP抵抗?fàn)顟B(tài)，對(duì)脂肪組織中的蛋白代謝具有良性改善作用，提示電針足三里和內(nèi)庭穴可能通過(guò)上述蛋白影響體內(nèi)一系列代謝過(guò)程。同樣的電針療程作用于正常飲食大鼠，ADPN和LP蛋白表達(dá)變化不顯著，顯示電針對(duì)正常大鼠體內(nèi)代謝影響不大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為解釋經(jīng)絡(luò)物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)體能量代謝方面提供一定的實(shí)驗(yàn)資料。鑒于本次樣本量較少，電針療程較短，該療效是否具有普遍性還有待增大樣本量及療程深入研究。課題組進(jìn)一步的研究方向?qū)⒓性谥炯?xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝失衡的發(fā)生機(jī)制(包括中樞和外周及其相互關(guān)系)和針刺效應(yīng)影響因素方面，為肥胖及相關(guān)疾病的針灸防治提供一個(gè)新的理論支撐。