補腎壯骨顆粒對SAMP6小鼠股骨宏觀結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)的影響

湯璐璐 鄧偉民* 蘇海容 袁人飛

1. 廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006 2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510403

5年臨床觀察發(fā)現(xiàn)補腎壯骨顆?？梢杂行Ь徑饨^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和老年男性骨質(zhì)疏松癥患者疼痛的癥狀，提高骨礦含量和骨密度，降低骨折發(fā)生率，且無明顯不良反應(yīng)，價格便宜[1-2]。衰老導(dǎo)致的生長激素分泌不足也是引發(fā)老年男性骨質(zhì)疏松的重要原因之一，文獻(xiàn)表明生長激素可以通過調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸刺激成骨細(xì)胞的復(fù)制和骨基質(zhì)的合成，防治中老年男性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，目前被認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松最有前途的藥物之一[3]，但研究表明rhGH的應(yīng)用會引發(fā)某些副作用，且有潛在致惡性腫瘤的風(fēng)險[4],價格昂貴，故對于生長激素的運用仍舊比較謹(jǐn)慎。本研究以快速老化雄性小鼠(senescence accelerated male mice,SAMP6)為老年男性骨質(zhì)疏松模型，以生長激素為陽性對照藥，分析補腎壯骨顆粒對SAMP6股骨結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能的影響，并探討是否有可能替代生長激素進(jìn)行對老年男性骨質(zhì)疏松的治療。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究以30只清潔級3月齡快速老化骨質(zhì)疏松模型雄性小鼠(SAMP6)和10只同源正常雄性小鼠(SAMR1)為研究對象。所有動物(許可證號：SCXK-津-2015-0003)均來自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心SAM品系小鼠繁育屏障系統(tǒng)，國家二級動物房飼養(yǎng)及運動干預(yù)，終年環(huán)境維持在相對濕度55%-60%，室溫23±2 ℃，每小時自動換風(fēng)16次，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)光照的條件。

1.2 方法

1.2.1藥物與儀器：補腎壯骨顆粒(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，批號15K04001)主要由骨碎補、龜甲膠、鹿角膠、淫羊藿、水蛭、山藥、巴戟天7味中藥組成，由廣州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供。尤得盼注射用重組人生長激素(4IU(1.33 mg)/瓶，產(chǎn)品批號UTR15020)由(株)LG生命科學(xué)制造，購自廣州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科。858MiniBionix型材料測試系統(tǒng)(MTS;USA)，Micro-CT儀(viva CT40;SCANCO Medical AG)。

1.2.2實驗分組及給藥方法：SAMP6(30只)被隨機平均分為模型組(MG)、中藥組(CMG)和生長激素組(GHG)，每組10只，選取10只正常老化雄性小鼠(SAMR1)作為同源對照組(NG)。每天給藥一次，給藥劑量為臨床等效劑量(補腎壯骨顆粒灌胃3.5 g/kg[5]，重組人生長激素皮下注射1μg/g)，模型組和正常組給予等量的生理鹽水。每隔一周進(jìn)行一次體重稱量，并結(jié)合體重調(diào)整給藥劑量。3個月后每組隨機選取5只小鼠去眼球取血處死，取其左側(cè)股骨，并徹底剔除軟組織，用Micro-CT儀掃描測定股骨骨量，858MiniBionix型材料測試系統(tǒng)行股骨三點彎曲應(yīng)力試驗測量與分析，加載速度為5 mm/min，跨距為10 mm,股骨斷裂后，用電子游標(biāo)卡尺測量橫截面外層長軸、外層短軸、內(nèi)層長軸、內(nèi)層短軸，6個月后采取同樣的方法處理剩余的小鼠。

1.2.3測量指標(biāo)：(1)股骨力學(xué)幾何尺寸 ①骨橫截面外層長軸②骨橫截面外層短軸③骨橫截面內(nèi)層長軸④骨橫截面內(nèi)層短軸⑤骨橫截面面積(bone)⑥骨髓腔橫截面積(Marrow cavity)⑦橫截面皮質(zhì)骨面積(Cortical bone)。

(2)股骨力學(xué)幾何量 截面慣性矩(moment of inertia)由公式(π/64)×(D14-D24)得出，極慣性矩(polar moment of inertia)由公式(π/32)×(D14-D24)得出，抗彎截面模數(shù)(Modulus of flexural)由公式(π/32)×(D14-D24)/D1得出，抗扭截面模數(shù)(Modulus of torsion)由公式(π/16)×(D14-D24)/D1得出，式中D1為股骨外徑(exter-diameter，平均值)，D2為骨髓腔內(nèi)徑(inter-diameter，平均值)。

(3)骨量參數(shù) 用Micro-CT儀掃描測定股骨整體骨礦密度(BMD)。

(4)生物力學(xué)性能 生物力學(xué)性能指標(biāo)采用858MiniBionix型材料測試系統(tǒng)測試得到:(1)結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)：①最大載荷(max-load)②彈性載荷(elasticity load)③最大繞度(Max-winding)④最大彎矩(max- bending moment)⑤能量吸收(absorption of energy)；(2)材料力學(xué)參數(shù)：①最大應(yīng)力(max-stress)②彈性應(yīng)力(elastic stress)③剛性系數(shù)(coefficient of rigidity)④彈性模量(modulus of elasticity)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對體重的影響

如表1所示，與正常組相比，3個月后模型組最終體重及增重量大于正常組，差異具有顯著性，6個月后模型組最終體重及增重量大于正常組，差異不具有顯著性；與模型組比較，3個月與6個月后生長激素組與中藥組最終體重及增重量均無顯著性差異。故認(rèn)為，補腎壯骨顆粒對快速老化雄性小鼠的體重變化無顯著性影響。

表1 各組小鼠體重變化Table 1 Weight change of mice in each group

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.2 骨生物力學(xué)性能

表2結(jié)果顯示，與正常組對比，3個月與6個月后模型組的股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)均降低，差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)，表明模型組小鼠抗壓能力減弱，脆性增加，此結(jié)果符合快速老化雄性小鼠的生長特性；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組的股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)均有提高，且差異具有顯著性(P<0.01)，6個月后生長激素組和中藥組的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)亦均有提高，其中生長激素組彈性載荷、最大繞度和最大彎矩差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中藥組最大載荷和彈性載荷差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與生長激素組對比，3個月后中藥組最大載荷、彈性載荷、最大繞度、能量吸收和最大彎矩均略有提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，6個月后中藥組彈性載荷、最大繞度、最大彎矩及能量吸收降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3所示，與正常組對比，3個月后模型組材料力學(xué)參數(shù)均降低，其中剛性系數(shù)和極限強度差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)，6個月后模型組材料力學(xué)參數(shù)亦均有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組材料力學(xué)參數(shù)均提高，其中兩組最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力、剛性系數(shù)差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)，6個月后生長激素組最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力、剛性系數(shù)有所提高，彈性模量有所降低，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中藥組彈性應(yīng)力、剛性系數(shù)有所提高，彈性模量有所降低，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，最大應(yīng)力基本無改變；與生長激素組對比，3個月后中藥組最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力提高，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，剛性系數(shù)和彈性模量降低，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，6個月后中藥組股骨材料力學(xué)參數(shù)均降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組骨結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)的結(jié)果Table 2 Results of mechanical parameters of bone structure in each group

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

表3 各組骨材料力學(xué)參數(shù)的結(jié)果Table 3 Results of mechanical parameters of bone materials in each group

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.3 股骨宏觀幾何結(jié)構(gòu)和皮質(zhì)骨面積

如表4和表5，與正常組對比，3個月和6個月后模型組股骨外徑及其橫截面積無顯著性差異，內(nèi)徑及其橫截面積增大，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積減小，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組股骨外徑、骨橫截面積增大，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，內(nèi)徑、骨髓腔橫截面積減小，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積增大，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)，6個月后生長激素組外徑及其橫截面積增大，內(nèi)徑及其橫截面積減小，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積增大，差異具有顯著性(P<0.01)，中藥組股骨外徑及其橫截面積增大，內(nèi)徑及其骨髓腔橫截面積減小，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積增大，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)；與生長激素組對比，3個月后中藥組線性幾何量和幾何截面積無統(tǒng)計學(xué)意義差異(P>0.05)，6個月后中藥組外徑及其橫截面積增大，內(nèi)徑及其橫截面積減小，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積增大，差異具有顯著性(P<0.01)。

表4 各組骨線性幾何量的結(jié)果Table 4 Results of linear geometric figures of bone in each

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

表5 各組骨幾何截面積的結(jié)果Table 5 Results of geometric sectional area of bone in each

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.4 股骨截面的力學(xué)幾何量

如表6，與正常組對比，3個月后模型組股骨截面的力學(xué)幾何量降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，6個月后模型組股骨截面的力學(xué)幾何量有降低但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組股骨截面的力學(xué)幾何量均有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，6個月后生長激素組股骨截面的力學(xué)幾何量均有所增加，其中抗扭截面模數(shù)和抗彎截面模數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)意義差異(P<0.05)，中藥組股骨截面的力學(xué)幾何量均增大，差異具有顯著性(P<0.01)；與生長激素組對比，3個月后中藥組股骨截面力學(xué)幾何量無差別，6個月后均有提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表6 各組骨力學(xué)截面幾何量的結(jié)果Table 6 Results of geometric section of bone mechanics in each

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.5 骨量

如表7，與正常組相比，3個月及6個月模型組骨礦密度持續(xù)降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組骨礦密度均降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，6個月后生長激素組和中藥組骨礦密度有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；與生長激素組對比，3個月和6個月后中藥組骨礦密度均提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表7 各組骨礦密度的結(jié)果Table 7 Results of bone mineral density in each

3 討論

快速老化型小鼠(senescence accelerated mouse,SAM)具有全身廣泛性骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加，低峰值骨密度，低峰值骨量等特點，與人類老年性骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)相似，是研究老年性骨質(zhì)疏松癥的理想模型[6]。本次研究3月和6月后測得結(jié)果均顯示模型組SAMP6小鼠較同期正常組SAMR1小鼠骨量減少，骨生物力學(xué)性能下降，皮質(zhì)骨厚度減小，且SAMP6小鼠檢測結(jié)果6月較3月骨質(zhì)疏松癥更為明顯，符合此次老年男性骨質(zhì)疏松模型的研究標(biāo)準(zhǔn)。

中醫(yī)對骨質(zhì)疏松的記載最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“刺腰痛”專篇。根據(jù)骨質(zhì)疏松臨床表現(xiàn)及發(fā)病機制，當(dāng)屬“骨痿”“骨痹”范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)從辯證角度分析骨質(zhì)疏松，認(rèn)為本病的病癥在于腎、脾、經(jīng)絡(luò)，其病機特點為腎脾虛和瘀血，腎虛是發(fā)病的根本，瘀血是重要原因[7]。補腎壯骨顆粒是綜合了補腎、健脾、祛瘀理念并結(jié)合臨床經(jīng)驗調(diào)配而成的中藥復(fù)方，方中淫羊藿、鹿角膠、龜甲膠、骨碎補、巴戟天補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕，山藥健脾和胃益腎，水蛭活血祛瘀止痛。諸藥合用共奏補腎壯骨、健脾和胃、活血祛瘀之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿有降低破骨細(xì)胞活性、活躍成骨細(xì)胞的作用；鹿角膠、龜甲膠有強壯的作用，能增強組織細(xì)胞的再生過程，提高機體適應(yīng)性過程；巴戟天、骨碎補有調(diào)節(jié)性激素的作用，諸藥配合組成的補腎壯骨顆粒有改善下丘腦-垂體-性腺軸功能，抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成。生長激素可以通過調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸刺激成骨細(xì)胞的復(fù)制和骨基質(zhì)的合成，防治中老年男性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

大量文獻(xiàn)表明單純測定骨密度不能發(fā)現(xiàn)包括器官和組織水平的結(jié)構(gòu)特性信息，不能完全反映骨的力學(xué)完整性[8]。本研究顯示前3個月補腎壯骨顆粒對SAMP6小鼠的骨含量并未起到積極作用，反而使骨含量降低，但骨生物力學(xué)有著顯著性的改善，此結(jié)果也再次印證了單純依靠測定骨密度來評價治療骨質(zhì)疏松藥物療效的不科學(xué)性；結(jié)合3月和6月后骨線性幾何量的結(jié)果分析此現(xiàn)象，原因可能是補腎壯骨顆粒更多的促進(jìn)SAMP6小鼠皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞的形成，對松質(zhì)骨的影響較遲緩，使得股骨外徑增大，但骨質(zhì)空隙率改善不明顯，進(jìn)而使直觀測量的骨礦密度降低；6個月后結(jié)果顯示補腎壯骨顆粒提高了SAMP6小鼠的骨含量，且高于生長激素組，說明長期服用補腎壯骨顆粒對SAMP6小鼠松質(zhì)骨有顯著性的改善且優(yōu)于生長激素，以上需對其骨微結(jié)構(gòu)的研究加以確定。對于骨質(zhì)疏松動物模型，任何治療最重要的目是改善骨的生物力學(xué)性能。骨生物力學(xué)是通過研究骨組織在外界作用下的力學(xué)特性和生物學(xué)效應(yīng)的特點，來反映骨量和骨內(nèi)在結(jié)構(gòu)以及骨組織的抗骨折能力的情況，是一種可評價各種對抗骨丟失措施的方法[9]。由骨生物力學(xué)性能結(jié)果得知，補腎壯骨顆粒治療3個月后能夠顯著性改善SAMP6小鼠的骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能(P<0.01或P<0.05)，提高最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力和剛性系數(shù)(P<0.05)；治療6個月后結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)參數(shù)也有所提高，其中最大載荷和彈性載荷差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明隨著SAMP6小鼠年齡的增長，骨量丟失和骨脆性的加大，補腎壯骨顆粒在一定程度上可以改善SAMP6小鼠的股骨結(jié)構(gòu)連續(xù)性，增加骨質(zhì)韌性，增強骨強度，提高骨剛度及抗骨變性和骨折能力。兩個用藥組結(jié)果顯示，補腎壯骨顆粒對SAMP6小鼠的骨生物力學(xué)性能影響與生長激素干預(yù)結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，即補腎壯骨顆粒在改善SAMP6小鼠的生物力學(xué)性能方面可以與生長激素相匹敵。

早期研究表明，人體骨骼在基本發(fā)育過程中，股骨的截面幾何結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)骨的外徑不斷增粗，骨髓腔直徑漸漸擴大，骨皮質(zhì)厚度和骨皮質(zhì)面積不斷增加，骨的截面幾何模量不斷增大，骨骼的穩(wěn)定性和力學(xué)強度大大增加，以適應(yīng)人體體重及活動增加的力學(xué)要求。骨的這種截面宏觀幾何結(jié)構(gòu)的變化是符合結(jié)構(gòu)力學(xué)原理(結(jié)構(gòu)分布離中心越遠(yuǎn)，結(jié)構(gòu)力學(xué)性能越優(yōu))的生理結(jié)構(gòu)代償機制,即骨幾何結(jié)構(gòu)生物力學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)機能。隨著年齡的增長和器官的老化進(jìn)而導(dǎo)致骨生物力學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)機能的減弱也是老年期骨生物力學(xué)性能下降的主要原因[10-11]。本次對SAMP6小鼠股骨截面幾何結(jié)構(gòu)的研究證明，補腎壯骨顆粒能夠改變SAMP6小鼠股骨內(nèi)外經(jīng)顯著性增加皮質(zhì)骨厚度，減小骨髓腔面積，增大皮質(zhì)骨面積，提高骨的截面慣性矩、抗彎截面模數(shù)、極慣性矩、抗扭截面模數(shù)(P<0.01或P<0.05)，且6個月后中藥組皮質(zhì)骨厚度和橫截面積較生長激素組有顯著性增大(P<0.01)，即補腎壯骨顆粒比生長激素更能促進(jìn)或加強SAMP6小鼠的股骨宏觀幾何結(jié)構(gòu)的生物力學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)機能，積極影響骨的生物力學(xué)性能。

綜上可推斷，補腎壯骨顆粒應(yīng)具有調(diào)節(jié)老年男性骨質(zhì)疏松癥患者的骨宏觀幾何結(jié)構(gòu)的力學(xué)應(yīng)答機能的功能，進(jìn)而改善骨的生物力學(xué)性能，增強骨質(zhì)韌性，增加骨強度，提高抵抗外力變形和骨折的能力，其效果與生長激素相當(dāng)，故可以考慮選擇價格便宜且安全的補腎壯骨顆粒替代價格昂貴且風(fēng)險較大的生長激素對老年男性骨質(zhì)疏松癥的治療。