緩激肽B2受體基因多態(tài)性+9/-9bp對骨關(guān)節(jié)炎患者血清NO產(chǎn)物水平的影響

施犇 陳爍 趙建寧

第二軍醫(yī)大學(xué)南京臨床醫(yī)學(xué)院 南京總醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210002

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)泛指發(fā)生在人體關(guān)節(jié)及其周圍組織的無菌性炎性疾病，OA的主要特點是關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞、骨贅形成及關(guān)節(jié)間隙變窄等，這些將導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、畸形和患者的功能障礙，其發(fā)病率高，致殘率高，將是影響人們生活質(zhì)量和健康的關(guān)鍵性問題[1,2]，OA的病因?qū)W尚不明確，研究表明年齡、創(chuàng)傷、自身免疫反應(yīng)和力學(xué)因素都與OA的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3,4]。除了經(jīng)典的誘發(fā)因素，研究已經(jīng)表明，基因多態(tài)性可能與OA的發(fā)病機制有關(guān)[5-7]。由于診斷方法有限，目前的治療OA主要是控制炎癥同時緩解患者痛苦。據(jù)報道緩激肽B2受體(Bradykinin B2 receptor，BDKRB2)拮抗劑的應(yīng)用，對患有膝關(guān)節(jié)OA患者產(chǎn)生持久的鎮(zhèn)痛效果，這意味著OA進展中緩激肽有潛在的關(guān)鍵作用[8,9]。

緩激肽(Bradykinin，BK)是由激肽釋放酶作用于激肽原而產(chǎn)生的寡肽酶，對大部分的炎癥反應(yīng)包括充血、蛋白滲出和疼痛都有作用[10,11]。這些BK有助于炎癥的啟動和維持，進而導(dǎo)致疼痛，高代謝狀態(tài)，隨后軟骨細(xì)胞凋亡，關(guān)節(jié)軟骨變性。這些反應(yīng)大多數(shù)是由BDKRB2介導(dǎo)的[12]。BDKRB2廣泛分散在身體的大部分組織中從而介導(dǎo)大多數(shù)的炎癥事件，包括通常受到OA影響的關(guān)節(jié)組織[13]，BDKRB2被認(rèn)為是一個強大的血管舒張和炎癥介質(zhì)，它是通過增加產(chǎn)生和釋放一氧化氮(Nitric Oxide，NO)產(chǎn)物來實現(xiàn)。有研究表明在風(fēng)濕性疾病里一些類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和OA患者的血清和關(guān)節(jié)液樣本中亞硝酸鹽濃度的增加[14]。

BDKRB2的轉(zhuǎn)錄被其受體的基因多態(tài)性影響，一些研究報道，BDKRB2基因多態(tài)性+9/-9 bp與受體的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)[15,16]。另有研究表明BDKRB2受體基因多態(tài)性與一系列的病理的改變有關(guān)聯(lián)包括糖尿病[17]，肺動脈壓力[18]和左心室量增加導(dǎo)致的高血壓[19]。我們以前研究最初揭示BDKRB2多態(tài)性(+9/-9 bp和-58 t / C)和OA的易感性以及嚴(yán)重性之間的關(guān)系[20]。盡管我們已經(jīng)了解到BDKRB2在炎癥中作用以及其基因多態(tài)性與OA的關(guān)系，但是BDKRB2基因多態(tài)性在滑膜炎癥的作用機制仍尚不清楚。已經(jīng)知道BDKRB2與OA的關(guān)系，還有與NO產(chǎn)物的關(guān)系，以及NO產(chǎn)物和炎癥之間的聯(lián)系，現(xiàn)在我們試圖探索在OA可能參與炎癥反應(yīng)中BDKRB2的基因多態(tài)性和NO產(chǎn)物之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 對象

從2015年6月到2016年11月156例我院收治的膝關(guān)節(jié)OA患者和58健康志愿者參加了這次研究。這項研究是南京總醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)，研究的所有參與者都簽署了書面知情同意。診斷膝關(guān)節(jié)OA的標(biāo)準(zhǔn)是基于美國大學(xué)風(fēng)濕病學(xué)標(biāo)準(zhǔn)以及用凱爾格倫-勞倫斯(Kellgren-Lawrence，KL)分級評估OA的嚴(yán)重性?；颊咴\斷為其他類型的膝關(guān)節(jié)疾病而不是患有OA則被排除。對照組為沒有關(guān)節(jié)炎病史或相關(guān)癥狀如關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、壓痛或活動受限。記錄實驗對象所有的危險因素包括性別、年齡、膝關(guān)節(jié)活動、身體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，BMI)、吸煙狀況和運動情況。BMI>30 kg/M2被定義為肥胖。

1.2 BDKRB2基因分型

DNA從外圍血液樣本中提取，使用DNA分離試劑盒 (Qiagen，Valencia，CA，USA)。BDKRB2基因多態(tài)位點(+ 9/-9，rs5810761)的檢測根據(jù)前用方法[21]。等位基因和基因型頻率在OA患者和對照組之間比較使用卡方分布檢驗或者Fisher精確檢驗(n<5)，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 實時定量PCR

滑膜組織標(biāo)本來自156 例關(guān)節(jié)置換手術(shù)OA患者。由于倫理問題健康組沒有獲得滑膜。比較不同的基因型BDKRB2在OA患者中的表達(dá)水平，RNA從滑膜組織提取并使用第一鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen，Grand Island NY，USA)合成cDNA?；虮磉_(dá)是由定量實時PCR使用Prime Time Mini qPCR Assays (Integrated DNA Technologies，Iowa，USA)。PCR反應(yīng)用ABI 7900HT序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)顯示。BDKRB2基因定量表達(dá)通過與管家基因HPRT1、GAPDH和18 s的平均表達(dá)水平的比較獲得。每個cDNA樣本，都有3管樣品進行測量(18 s(n=3)，GAPDH(n=3)，HPRT1(n=3)，和BDKRB2(n=3))。三個管家基因平均Ct值(3x3)被用來和BDKRB2對照比較。相對的BDKRB2及其變異型的表達(dá)水平通過使用2-ΔCt方法與管家基因水平進行分析。Kruskal-Wallis tests進行檢驗BDKRB2+9/-9 bp多態(tài)性相對于對照的表達(dá)是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。所有的引物和探針序列表1中可見。

1.4 NO產(chǎn)物的測定

收集血液樣本通過EDTA離心管的獲得血清，在4 ℃下2500轉(zhuǎn)離心10分鐘，然后在-70 ℃保存，直到分析。NO產(chǎn)物通過間接使用NO試劑盒(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)測量NO衍生物硝酸鹽和亞硝酸鹽的量獲得。取血清樣本(50 μL)被添加到96孔板，通過Griess試劑顯色，吸光度通過照度計讀板確定在540 nm。

表1 BDKRB2定量PCR中各基因引物序列和探針Table 1 The primers for quantitative PCR analysis of BDKRB2.

2 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件分析(SPSSv21)。相關(guān)數(shù)據(jù)分析使用Pearson相關(guān)檢驗。多元回歸分析是為了驗證發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性和重要性。統(tǒng)計學(xué)意義是評估使用雙側(cè)Mann-Whitney-U檢驗，Kruskal-Wallis檢驗和t檢驗分別檢驗非參數(shù)和正態(tài)分布數(shù)據(jù)，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

實驗對象OA患者的BMI明顯高于對照組(P=0.001)，但在其他人口學(xué)和臨床特征方面，如性別、年齡、吸煙狀態(tài)、體力勞動、家族史情況等，并無明顯差異(表2)。

表2 研究對象的人口學(xué)及臨床特點Table 2 Demographic and clinical characteristics of all subjects in the study.

注：ns：無顯著差異；*：有顯著差異。

Note，ns: not significant.*：Statistically significant.

為研究緩激肽B2受體基因多態(tài)性+9/-9與骨關(guān)節(jié)炎患者血清NO產(chǎn)物的關(guān)系，血清NO衍生物硝酸鹽和亞硝酸鹽被檢測。結(jié)果顯示與+9/+9 bp基因型組相比，+9/-9 bp和-9/-9 bp患者血清NO水平更高(圖1 A)。相關(guān)性分析顯示BDKRB2 mRNA與NO水平呈顯著正相關(guān)(圖1B，Pearson相關(guān)系數(shù)=0.458，P<0.001)。血清NO產(chǎn)物水平與骨關(guān)節(jié)炎放射學(xué)分型之間的關(guān)系分析結(jié)果顯示與健康對照者相比，骨關(guān)節(jié)炎患者血清NO水平顯著升高，且隨著KL評分增加而增加(圖2)。

圖1 BDKRB2基因多態(tài)性+9/-9 bp對OA患者血清NO產(chǎn)物水平的影響Fig.1 Effect of the BDKRB2 +9/-9 bp polymorphism on NO production in serum samples of OA patients.

圖2 血清NO產(chǎn)物水平與OA嚴(yán)重程度的關(guān)系Fig.2 Correlation between serum NO production levels and the severity of OA.

逐步多元線性回歸(MLR)分析血清NO水平相關(guān)的預(yù)測因子，確定了幾個重要的獨立預(yù)測因子：BDKRB2多態(tài)性、肥胖、KL分級、性別和年齡，用于隨后的MLR分析。因變量OA血清NO水平MLR分析表明，BDKRB2多態(tài)性、肥胖和OA評分與血清NO水平呈獨立相關(guān)性(表3)。在所有OA患者中，血清NO水平與BDKRB2多態(tài)性、肥胖和OA評分的相關(guān)系數(shù)分別為0.806(P<0.001)、-0.188(P=0.009)、0.772(P<0.001)。經(jīng)性別和年齡兩因素校正后，MLR分析表明血清NO水平與BDKRB2多態(tài)性和KL評分均呈正相關(guān)(β=0.804；95% CI， 8.37 to 10.60和β=0.259；95% CI，0.74 to 4.45)，與肥胖呈負(fù)相關(guān)(β=-0.132；95% CI，3.75 to -0.65)。

表3 逐步多元線性回歸(MLR)分析OA患者血清NO水平相關(guān)的預(yù)測因子Table 3 Multiple linear regression of the dependent variable serum NO level in OA patients.

注：復(fù)相關(guān)系數(shù)=0.682，校正決定系數(shù)=0.676

Note，Multiple R2=0.682, Adjusted R2=0.676

4 討論

OA是一種引起疼痛并導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能逐漸喪失的退行性關(guān)節(jié)疾病，如不及時加以治療，最終令患者致殘并嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量[22]。該病不僅發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨損害，還累及整個關(guān)節(jié)，包括軟骨下骨[23]、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周圍肌肉，最終發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨退變、纖維化、破裂、潰瘍及整個關(guān)節(jié)面的損害。骨關(guān)節(jié)炎的病因尚不明確，研究表明年齡、創(chuàng)傷、激素和機械因素都與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[24,25]。

近年來，大量研究已經(jīng)揭示BK在各種生理反應(yīng)中的重要作用，例如：炎癥反應(yīng)，血管通透性的改變，低血壓，水腫[26]，平滑肌的收縮以及體內(nèi)糖的平衡[27]，現(xiàn)已知緩激肽絕大多生理作用是由BDKRB2介導(dǎo)的[28]，在這項研究中我們繼續(xù)探討了BDKRB2基因多態(tài)性在OA患者的滑膜中的基因表達(dá)和NO產(chǎn)物水平的作用。我們的結(jié)果顯示，BDKRB2基因多態(tài)性+9/-9 bp與受體基因的表達(dá)和NO產(chǎn)物水平具有相關(guān)性。

NO被認(rèn)為是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要因素，其作用包括協(xié)調(diào)表達(dá)促炎細(xì)胞因子、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡以及抑制膠原蛋白和蛋白聚糖的合成。以前的研究當(dāng)中已經(jīng)證實在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及骨關(guān)節(jié)炎NO產(chǎn)物水平是增高的[14,29,30]。在我們的研究當(dāng)中，NO產(chǎn)物水平在OA患者中相比正常人的水平要高，同時也和其OA患者疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。盡管較高NO產(chǎn)物是促進炎癥的重要因素，但是NO在炎癥中如何作用仍不明確。近來研究提示NO及其氧化還原產(chǎn)物可能對軟骨細(xì)胞具有保護作用[31]，進一步研究可能有助于闡述NO在OA進程中的潛在作用。

在OA患者的滑膜中BK是一種具有舒張血管及促成炎癥的直鏈9肽，它通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO來產(chǎn)生舒張血管的作用。BDKRB2受體廣泛存在于包括關(guān)節(jié)組織在內(nèi)的各種組織中，骨關(guān)節(jié)炎患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和滑膜襯里細(xì)胞都檢測出BDKRB2[32]。它通過引發(fā)并維持炎癥反應(yīng)，刺激神經(jīng)纖維并提高神經(jīng)纖維敏感性，從而導(dǎo)致疼痛，激活滑液和軟骨中內(nèi)環(huán)境平衡的主要細(xì)胞：滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞另外還能協(xié)同增強促炎因子產(chǎn)生的作用，持續(xù)表達(dá)于多數(shù)組織，通過持續(xù)產(chǎn)生和釋放一氧化氮產(chǎn)生強烈的擴張血管和致炎效果[33]。我們發(fā)現(xiàn)在OA患者滑膜組織中BDKRB2的水平和血清中NO產(chǎn)物水平是正相關(guān)的，然而其中的機制仍不清楚，有可能和NO通路的誘導(dǎo)途徑有關(guān)。

人類的BDKRB2基因位于染色體14q32[34]，基因含有數(shù)個多態(tài)位點，在基因的第1個外顯子有9個堿基對的插入點/缺失點(+9/-9，rs5810761)，啟動子區(qū)有C-T轉(zhuǎn)換點(C -58T，rs1799722)[35]。既往研究已經(jīng)表明BDKRB2+9/-9 bp多態(tài)性與基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[15,16]。在這次研究當(dāng)中我們試圖去檢驗BDKRB2 +9/-9 bp基因多態(tài)性對骨關(guān)節(jié)炎的患者的NO產(chǎn)物是否有影響，結(jié)果顯示在OA患者中與+9/+9 bp基因型組相比，+9/-9 bp和-9/-9 bp患者血清NO水平更高。多元線性回歸(MLR)分析血清NO產(chǎn)物水平與BDKRB2基因多態(tài)性和關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度成正相關(guān)。我們的數(shù)據(jù)可能提示在OA的患者中-9 bp等位基因的攜帶者可能BDKRB2更多的轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致緩激肽的作用產(chǎn)生更多的NO產(chǎn)物從而影響OA的發(fā)生發(fā)展。

此次研究還具有一定的局限性，首先一定比例的肥胖患者納入此次研究，尤其有1例BMI值相當(dāng)高的病例出現(xiàn)在我們研究的OA患者當(dāng)中，這可能誤認(rèn)為在OA的發(fā)生發(fā)展中肥胖不僅是作為一個機械的重要因素，也可能作為從細(xì)胞水平影響的重要因素，另外在納入患者中可能存在一定的偏移。其次盡管BDKRB2的表達(dá)與NO產(chǎn)物的有相關(guān)性，然而BDKRB2多態(tài)性與OA的嚴(yán)重程度的機制還需進一步分析揭示。

我們的研究結(jié)果表明BDKRB2基因多態(tài)性+9/-9 bp可能影響著基因的表達(dá)和NO產(chǎn)物的水平，同時NO產(chǎn)物水平也和OA嚴(yán)重程度正相關(guān)。BDKRB2基因多態(tài)性與OA易感性和嚴(yán)重程度得到進一步驗證。BDKRB2基因多態(tài)性在OA的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，可能作為一類重要的基因調(diào)節(jié)機制。