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    一種注射桑樹(shù)冬芽轉(zhuǎn)化方法的初探

    2018-08-01 05:35:26林天寶計(jì)東風(fēng)呂志強(qiáng)
    蠶桑通報(bào) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:桑果桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因

    林天寶,劉 巖,計(jì)東風(fēng),朱 燕,魏 佳,呂志強(qiáng)

    (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑研究所,浙江 杭州 310021)

    桑樹(shù)是一種重要經(jīng)濟(jì)林木,在食品、醫(yī)藥保健、繭絲綢和生態(tài)等領(lǐng)域都具有重要作用[1~2]。長(zhǎng)期以來(lái),桑樹(shù)主要通過(guò)雜交和多倍體育種方式進(jìn)行品種改良,雖然已經(jīng)選育多個(gè)優(yōu)良品種,但由于桑樹(shù)生長(zhǎng)周期長(zhǎng),遺傳雜合性高,傳統(tǒng)的育種方法往往需要花費(fèi)漫長(zhǎng)時(shí)間,并且很難做到對(duì)有價(jià)值遺傳性狀的定向育種[3~5]。

    隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),導(dǎo)入優(yōu)良的外源基因,將有利于定向提高桑葉的產(chǎn)量和質(zhì)量,增強(qiáng)桑樹(shù)抗病性和抗逆性的研究[5~8]。桑樹(shù)上最早的轉(zhuǎn)基因報(bào)道是日本學(xué)者M(jìn)achii等[9]利用農(nóng)桿菌LBA4404浸染桑樹(shù)葉片,誘導(dǎo)獲得GUS組織化學(xué)染色陽(yáng)性的不定芽。此后,陸小平等[10~11]對(duì)桑樹(shù)幼苗子葉腋隙進(jìn)行刺傷,接種感染工程農(nóng)桿菌,利用GUS基因、Km記恨做探針的檢測(cè)到較強(qiáng)的雜交信號(hào);王洪利等[12]利用桑樹(shù)莖尖的轉(zhuǎn)化法報(bào)道由初步研究結(jié)果。Vibha[13]在印度桑(Morus indica L.cv.K2)中過(guò)表達(dá)大麥(barley)胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白家族成員HVA1,證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物耐旱、耐鹽和抗寒性都得到改善[14~15]。2011 年,Manaswini等將Osmotin蛋白基因轉(zhuǎn)入K2印度桑中,轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱、鹽脅迫以及真菌脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性[16]。然而除印度桑外,其他關(guān)于桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究的報(bào)道仍相對(duì)較少,特別是國(guó)內(nèi)實(shí)用果桑品種的遺傳轉(zhuǎn)化方面。西南大學(xué)李鎮(zhèn)剛等人[17]利用花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行了研究;以及近年陸續(xù)有報(bào)道利用桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因毛狀根的誘導(dǎo)和繁殖方法、病毒介導(dǎo)的基因沉默的研究探索等;但總體上,采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行桑樹(shù)遺傳育種的研究尚處于起步階段,還亟需開(kāi)展更多地探索和研究。

    為此,本文選擇萌動(dòng)期的桑樹(shù)冬芽,以注射方法轉(zhuǎn)化攜帶β-glucuronidase(GUS)和卡那霉素(Kan)報(bào)告基因的重組農(nóng)桿菌,對(duì)冬芽處理枝條的葉片進(jìn)行GUS酶活性染色和特異性片段的PCR擴(kuò)增鑒定,以及果實(shí)的GUS染色、桑種子的卡那霉素抗性篩選研究。結(jié)果證實(shí)通過(guò)該方法能篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)植株,這為今后開(kāi)展桑樹(shù)功能基因研究和品種改良選育提供了參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

    攜帶β-葡萄糖甘酸酶基因(GUS)和抗卡那霉素(Kan)報(bào)告基因的根癌農(nóng)桿菌菌株(GV-pBI121)由浙江省農(nóng)科院沈國(guó)新研究員惠贈(zèng)。所含標(biāo)記基因GUS受花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子控制。

    1.2 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

    取保存菌種接種在含有卡那霉素(Kan 100 mg·L-1)和利福平(Rif 50 mg·L-1)兩種抗生素的LB培養(yǎng)基上,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),挑取單菌落,接種于含有卡那霉素(50 mg·L-1)和利福平(50 mg·L-1)的液體LB培養(yǎng)基,置28℃恒溫下震蕩培養(yǎng)(200 r·min-1)至菌液濃度(OD600=0.5)時(shí)備用。

    1.3 供試桑樹(shù)品種及浸染轉(zhuǎn)化

    試驗(yàn)用臺(tái)灣果桑品種72C002由本課題組基地栽培和保存。選擇冬芽即將萌發(fā)前作為微注射轉(zhuǎn)染時(shí)期。取上述菌液,室溫離心15 min(4000 r·min-1)。棄上清,用等量體積的浸染緩沖液(MES 0.25g·L-1,Myo-inositol 0.10g·L-1,MS with Gamborg Vitamins 2.22g·L-1,L-glutamine 0.20g·L-1,D-galactose 1.80g·L-1,pH 5.0)懸浮農(nóng)桿菌。利用1 ml注射器將農(nóng)桿菌浸染液注射入桑樹(shù)冬芽,每芽0.1 mL。注射完成后,取鋁箔紙包住枝條,暗處理48 h后,剝離鋁箔紙,繼續(xù)培養(yǎng)。分別采集農(nóng)桿菌注射后枝條生長(zhǎng)的葉片、桑果和桑種子做后續(xù)檢測(cè)分析。

    1.4 GUS酶活性顯色

    GUS酶活檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[18],取檢測(cè)樣品置于X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄醛酸)染色液(phosphate buffer 50 mmol·L-1,pH 7.0,F(xiàn)errocyanide 3 mmol·L-1,F(xiàn)erricyanide 3mmol·L-1,Triton X-100 0.2 mmol·L-1,X-Gluc 2 mmol·L-1)中,真空泵反復(fù)抽氣3次后,置于37恒溫箱染色過(guò)夜。然后棄去染色液,加入70%乙醇脫去樣品葉綠素,觀察并記錄樣品染色結(jié)果。

    1.5 DNA抽提及GUS基因的擴(kuò)增

    利用Omega植物基因組抽提試劑盒提取桑樹(shù)葉片、對(duì)照植株葉片的DNA,分別作為PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)GUS基因核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(GusF:5‘-CGT CCT GTA GAA ACCCCA ACCC-’;GusR:5‘-ATGCCATGTTCATCTGCCCAGT-3’)。根據(jù)KOD-Plus-Neo(TOYOBO公司,日本)酶說(shuō)明,配制PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min后,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸90 s。共循環(huán)35次。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,并在紫外燈下觀察、拍照。

    回收瓊脂糖凝膠上對(duì)應(yīng)大小的特異性條帶,并委托上海鉑尚生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。

    1.6 冬芽處理組桑果的檢測(cè)

    采摘冬芽處理枝條上結(jié)出的桑果,收集桑種子并烘干。用100 g·L-1次氯酸鈉對(duì)桑籽進(jìn)行消毒處理[19]后播種于含 100 mg·L-1的Kan 1/2 MS 培養(yǎng)基上。觀察并統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)情況

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    利用SPSS的平均數(shù)單因素方差分析方法,對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 桑樹(shù)冬芽的轉(zhuǎn)化

    以萌動(dòng)期桑樹(shù)72C002的冬芽為研究對(duì)象(圖1A),經(jīng)70%酒精擦拭消毒后,每個(gè)冬芽注射重組農(nóng)桿菌0.1 ml(圖1A,1B)。一周后,觀察芽尖開(kāi)始轉(zhuǎn)綠(圖1C);繼續(xù)觀察至第三周時(shí),芽尖上新葉長(zhǎng)大,開(kāi)始逐漸伸展張開(kāi)。這時(shí)觀察到由于受注射農(nóng)桿菌的影響,葉片葉尖和部分有萎黃卷曲表型出現(xiàn)(圖1D)。

    圖1 注射浸染桑樹(shù)冬芽及芽頭早期的生長(zhǎng)Figure 1 Progress of mulberry winter bud injection and its initial growth

    2.2 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

    冬芽處理8周后,隨機(jī)從6個(gè)冬芽生長(zhǎng)的枝條上采葉片,抽提取樣品DNA后,利用GUS基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。從PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖2)可知,有四組樣品擴(kuò)增到預(yù)計(jì)大小條帶,另外2個(gè)處理后的葉片樣品僅擴(kuò)增得到非特異性的雜帶;同時(shí),正常未處理對(duì)照植株來(lái)源的葉片樣品檢測(cè),擴(kuò)增均未獲得與GUS基因大小相對(duì)應(yīng)的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送鉑尚公司測(cè)序,證實(shí)擴(kuò)增序列與目標(biāo)基因GUS一致。

    圖2 轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)葉片的PCR擴(kuò)增檢測(cè)Figure 2 PCR measurement of the leaves of transgenic mulberry

    圖3 轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)葉片和果實(shí)的GUS染色觀察Figure 3 GUS staining of the leaves and fruits from transgenic mulberry tree

    圖4 轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)種子的抗性篩選Figure 4 Resistance selection of transgenic mulberry seeds

    2.3 冬芽處理枝條的GUS酶活性檢測(cè)

    隨機(jī)選取20個(gè)注射冬芽長(zhǎng)出的枝條,分別采集靠近枝頂端已經(jīng)完全張開(kāi)的葉片,進(jìn)行GUS染色。其中有9個(gè)枝條上葉片呈現(xiàn)出GUS酶著染的藍(lán)色結(jié)果,主要顯示在葉片葉脈附近(圖3A,3B)。

    采摘不同冬芽枝條上結(jié)的桑果10個(gè)進(jìn)行GUS酶活性染色,在其中2個(gè)桑果上觀察到GUS的表達(dá)主要在果柄和部分果肉細(xì)胞(圖3C,3D)。

    2.4 桑籽的抗性篩選

    采集GUS染色陽(yáng)性10個(gè)枝條上的桑果,同一冬芽來(lái)源的枝條上的桑果混合在一組,流水反復(fù)沖洗收集桑籽后,將采集好的桑籽置于30℃烘箱烘干。經(jīng)消毒后散播在含100 g·L-1卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)平板上,25℃恒溫培養(yǎng)10天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同組間發(fā)芽率(圖4)從0~16.67%不等,平均7.61%,組間偏差極顯著(P<0.01)。

    3 討論

    目前,非轉(zhuǎn)基因的桑樹(shù)育種方法在生產(chǎn)應(yīng)用廣泛,人們利用這些傳統(tǒng)的雜交、嫁接、多倍體誘導(dǎo)等技術(shù),已選育出很多性能優(yōu)良的實(shí)用化品種。但為了加快品種選育速度,提高選育的針對(duì)性,桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的探索一直備受關(guān)注[14]。本研究中,我們采用注射方法將重組農(nóng)桿菌導(dǎo)入桑樹(shù)冬芽,對(duì)轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)的GUS酶活性染色、特異性外源基因片段的擴(kuò)增和抗性篩選檢測(cè)外源基因已經(jīng)進(jìn)入轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)(圖2~4),GUS陽(yáng)性檢測(cè)率達(dá)45%;抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率平均為7.61%。但研究還同時(shí)發(fā)現(xiàn),GUS染色檢測(cè)陽(yáng)性率與基因組DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)率間陽(yáng)性率不一致,推測(cè)這可能與檢測(cè)樣本間差異以及檢測(cè)方法的靈敏度不同有關(guān)。

    本研究針對(duì)不同轉(zhuǎn)化枝條獲得桑籽的抗性篩選發(fā)芽率差異較大(圖4),已發(fā)芽的幼苗葉片抽提基因組DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)卻未擴(kuò)增到靶片段。分析可能與樓程富等[20]研究提出的未經(jīng)愈傷處理的新芽組織很難被T-DNA整合有關(guān),因?yàn)檗r(nóng)桿菌很難穿過(guò)角質(zhì)層和排列緊密有序的表皮細(xì)胞去完成貼壁反應(yīng)。Machii等[21]1996年利用基因槍轟擊桑樹(shù)懸浮愈傷組織,研究檢測(cè)到GUS陽(yáng)性,但最終并未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。

    在農(nóng)桿菌浸染桑樹(shù)品種的選擇上,已報(bào)道的桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因主要有新一之瀨、豐馳桑、白桑M5[3]、印度桑 K2[14,16],不同桑樹(shù)品種的遺傳轉(zhuǎn)化適應(yīng)性存在差異;縱使在組織培養(yǎng)時(shí),我們前期研究也發(fā)現(xiàn)適合川桑、滇桑、藥桑、印度桑無(wú)菌幼苗莖段和生根培養(yǎng)體系存在差異,并且培養(yǎng)基中激素濃度小幅變化都會(huì)對(duì)其繁殖系數(shù)造成明顯影響[22]。這些都提示今后可以利用更多的桑樹(shù)品種來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系;但本研究方法操作簡(jiǎn)單,這對(duì)今后桑樹(shù)實(shí)用品種的遺傳研究具有意見(jiàn)借鑒參考意義。

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