貴州六盤水市獼猴桃病害調(diào)查及病原鑒定

潘 慧, 胡秋舲, 張勝菊, 祖 達(dá), 李 黎*, 鐘彩虹*

(1.植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院武漢植物園, 武漢 430074;2.貴州六盤水市植保植檢站, 六盤水 553001)

獼猴桃果實(shí)營養(yǎng)豐富,富含維生素和多種礦質(zhì)元素及氨基酸,被譽(yù)為“水果之王”,是我國山區(qū)農(nóng)民精準(zhǔn)脫貧的特色優(yōu)勢(shì)樹種。自2007年以來,六盤水市開始大力發(fā)展獼猴桃種植產(chǎn)業(yè),主要栽培品種為‘紅陽’,全市獼猴桃種植基地覆蓋了猴場(chǎng)鎮(zhèn)、米籮鄉(xiāng)、野鐘鄉(xiāng)、都格鄉(xiāng)、楊梅鄉(xiāng)、雞場(chǎng)鎮(zhèn)、普古鄉(xiāng)、隴腳鄉(xiāng)及郎岱鎮(zhèn)等20個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)。截至2016年年底,全市獼猴桃栽培總面積達(dá)9 447 hm2,年產(chǎn)量達(dá)1.2萬t。

然而自2014年以來,六盤水市農(nóng)委植保植檢站發(fā)現(xiàn)該市各鄉(xiāng)鎮(zhèn)獼猴桃細(xì)菌性及真菌性病害日益突出,給當(dāng)?shù)孬J猴桃產(chǎn)業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失,因此需盡快對(duì)當(dāng)?shù)孬J猴桃病害進(jìn)行全面調(diào)查。中國科學(xué)院武漢植物園聯(lián)合六盤水市農(nóng)委分別于2015年10月、2016年4月及8月對(duì)六盤水市12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)26個(gè)代表性栽培園區(qū)進(jìn)行了周年采樣分析及病原鑒定,以期全面了解該地區(qū)范圍內(nèi)獼猴桃病害的種類、分布及危害程度,為針對(duì)性地開展檢疫和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及獼猴桃病害的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 園區(qū)感病樣本采集

2015年10月、2016年4月及8月對(duì)26個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行了感病樣本的采集。秋冬季共采集65份具有明顯病斑的葉片作為試驗(yàn)材料,春季共采集75份具有病斑的葉片、9份枝條及6份花朵樣本,夏季共采集71份具有病斑的葉片和15份果實(shí)樣本。各采樣點(diǎn)栽培品種均為‘紅陽’,具體地理位置見表1。

表1各采樣點(diǎn)具體地理位置

Table1Detailedlocationsofsamplingorchards

采樣園區(qū)編號(hào)No.ofsamplingorchard采樣季節(jié)Sampling season經(jīng)緯度Longitude andlatitude海拔/mAltitude所屬鄉(xiāng)鎮(zhèn)Township采樣園區(qū)編號(hào)No.ofsamplingorchard采樣季節(jié)Samplingseason經(jīng)緯度Longitude andlatitude海拔/mAltitude所屬鄉(xiāng)鎮(zhèn)Township1秋冬季、春季、夏季105°10'22″E 26°13'24″N1 150水城縣猴場(chǎng)鎮(zhèn)12春季104°47'35″E 26°18'44″N1 321水城縣發(fā)耳鎮(zhèn)2秋冬季、春季、夏季105°07'41″E 26°13'17″N1 024水城縣猴場(chǎng)鎮(zhèn)13春季104°45'02″E 26°16'45″N1 383水城縣發(fā)耳鎮(zhèn)3秋冬季104°57'48″E 26°25'09″N1 103水城縣米籮鎮(zhèn)14春季104°39'20″E 26°18'37″N967水城縣發(fā)耳鎮(zhèn)4秋冬季104°58'20″E 26°24'29″N1 073水城縣米籮鄉(xiāng)15春季104°40'18″E 26°15'49″N1 223水城縣雞場(chǎng)鄉(xiāng)5秋冬季、春季、夏季105°23'48″E 26°04'25″N1 305六枝特區(qū)郎岱鎮(zhèn)16春季104°41'06″E 26°17'58″N1 088水城縣雞場(chǎng)鄉(xiāng)6秋冬季、春季、夏季104°49'51″E 26°04'38″N1 370盤縣普古鄉(xiāng)17春季105°08'48″E 26°24'15″N1 272水城縣蟠龍鎮(zhèn)7秋冬季、夏季104°48'08″E 26°04'25″N1 199水城縣雞場(chǎng)鄉(xiāng)18春季105°07'21″E 26°21'27″N1 232水城縣蟠龍鎮(zhèn)8秋冬季、春季104°41'24″E 26°20'27″N1 070水城縣都格鄉(xiāng)19春季105°07'45″E 26°17'17″N812水城縣猴場(chǎng)鎮(zhèn)9秋冬季104°53'00″E 28°27'00″N1 260水城縣勺米鄉(xiāng)20春季104°58'51″E 26°22'00″N1 255水城縣米籮鎮(zhèn)10A秋冬季104°51'17″E 26°29'38″N1 269水城縣順場(chǎng)鄉(xiāng)21春季104°58'13″E 26°11'54″N1 181水城縣野鐘鄉(xiāng)10B春季104°51'29″E 26°14'00″N1 261水城縣順場(chǎng)鄉(xiāng)22夏季104°47'51″E 26°18'28″N1 470水城縣楊梅鄉(xiāng)10C春季104°52'39″E 26°13'51″N1 334水城縣順場(chǎng)鄉(xiāng)23夏季104°49'00″E 26°36'02″N1 157水城縣米籮鎮(zhèn)11秋冬季、春季104°35'26″E 26°13'45″N1 255水城縣米籮鎮(zhèn)24夏季104°49'25″E 26°36'03″N1 113水城縣米籮鎮(zhèn)

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)

1.2.1 細(xì)菌性病原菌的分離和培養(yǎng)

采用直徑1 cm的打孔器從葉片或枝條的病健交界處打取3片組織，用70%乙醇進(jìn)行表面消毒后將葉片組織置于1.5 mL離心管中勻漿(每管內(nèi)加入400 μL 10 mmol/L MgSO4和2粒鋼珠)。對(duì)勻漿液進(jìn)行100～10-4梯度稀釋，取100 μL 10-4稀釋勻漿液涂布于假單胞菌專用分離培養(yǎng)基 KB CFC固體培養(yǎng)基，置于27～28℃培養(yǎng)，2 d后挑取單菌落進(jìn)行劃線分離。對(duì)生物學(xué)特征近似丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)的菌落進(jìn)行氧化酶測(cè)試，保存氧化酶測(cè)試呈陰性的菌落。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 真菌性病原菌的分離和培養(yǎng)

對(duì)于每一份葉片樣本,采用直徑1 cm的打孔器從病健交界處打取3片葉片組織,用70%乙醇進(jìn)行表面消毒,置于PDA培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)3 d。對(duì)于果實(shí)樣本,用無菌手術(shù)刀切取病健交界處的果肉組織置于PDA培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)3 d。平板出現(xiàn)菌落后挑取菌絲尖端于新PDA平板上純化,直至獲得純菌株。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 細(xì)菌菌落PCR

挑選新鮮菌落置于20 μL無菌水中,98℃裂解10 min之后渦旋,快速短暫離心,吸取2 μL上清液作為DNA模板。參照Rees-George等[1]的方法運(yùn)用Psa特異引物PsaF1(TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT)和PsaR2(CACGCACCCTTCAATCAGGATG)進(jìn)行分子鑒定。反應(yīng)體系為10 μL,其中含Mg2+的10×PCR buffer 1 μL,10 mmol/L dNTPs 0.2 μL,100 μmol/L PsaF1引物和PsaR2引物各0.1 μL,1.10 g/mL DMSO 0.2 μL,5 U/μLTaq酶0.1 μL,菌落模板2 μL,無菌去離子水6.3 μL;PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測(cè),觀察是否有目的片段條帶。Psa菌株可擴(kuò)增得到280 bp的目的條帶。

1.3.2 真菌ITS鑒定

純化的菌株在PDA平板上25℃培養(yǎng)5 d后,用打孔器制成直徑5 mm的菌餅,將菌餅接入40 mL PD液體培養(yǎng)基中,25℃靜置培養(yǎng)5～8 d后收集菌絲。運(yùn)用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA,并將DNA置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

采用真菌核糖體基因組轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS4/ITS5對(duì)真菌病原菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)。反應(yīng)體系為40 μL,其中含Mg2+的10×PCR buffer 4 μL,10 mmol/L dNTPs 0.8 μL,100 μmol/L引物各0.2 μL,1.10 g/mL DMSO 0.8 μL,5 U/μLTaq酶0.25 μL,DNA模板2 μL,無菌去離子水31.75 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min;94℃ 30s,55℃30 s,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),目的條帶為600 bp。將PCR產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI已發(fā)表菌株序列進(jìn)行BLAST比對(duì),作同源性相似差異性分析,確定菌株的分類地位。

1.4 致病力測(cè)試

將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌株用5 mm無菌打孔器制成菌餅。同時(shí)將葉片和果實(shí)的表面用2號(hào)解剖針進(jìn)行針刺,果實(shí)刺傷深度為2～3 mm,將菌餅接種于傷口處,菌絲面朝下,再覆蓋濕棉球,并放入透明盒中密封保濕,6 d后觀察各處理發(fā)病情況。以接種PDA瓊脂塊為對(duì)照。每個(gè)菌株在葉片及果實(shí)上的接種試驗(yàn)均重復(fù)3次。發(fā)病后從病斑再次分離培養(yǎng)病原菌,與原接種菌株進(jìn)行比較鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病癥狀

采樣期間,在六盤水市部分獼猴桃栽培園區(qū)觀察到疑似褐斑病、灰斑病、軟腐病、潰瘍病和炭疽病的癥狀(圖1),主要感病癥狀與李黎等[2]、羅祿怡等[3]的描述一致。疑似褐斑病感病癥狀:葉面上的病斑較小,約3～15 mm,近圓形至不規(guī)則形;病斑外沿深褐色,中部色淺。疑似灰斑病感病癥狀:前期癥狀與褐斑病相似,葉背病斑黑褐色,葉面暗褐至灰褐色。疑似炭疽病感病癥狀:葉緣略向葉背卷縮,病健交界明顯,病斑中間為灰白色,邊緣深褐色。疑似潰瘍病感病癥狀:葉片上不規(guī)則形或多角形褐色斑點(diǎn),病斑周圍有3～5 mm明顯的黃色暈圈。疑似軟腐病感病癥狀:發(fā)病部位表皮出現(xiàn)類似大拇指壓痕斑,剝開凹陷部表皮,病部中心果肉呈乳白色,周圍果肉呈黃綠色水漬狀。

圖1 六盤水市獼猴桃栽培園區(qū)主要病害感病癥狀Fig.1 Symptoms of main kiwifruit disease in cultivating orchards in Liupanshui City

2.2 細(xì)菌性病原菌的鑒定結(jié)果

春季細(xì)菌性病原菌的鑒定結(jié)果：采樣點(diǎn)16、18、2、20、10B、10C、5、6的枝條及葉片樣本攜帶Psa病原菌。夏季細(xì)菌性病原菌的鑒定結(jié)果：采樣點(diǎn)5、6的葉片樣本攜帶Psa病原菌。秋冬季細(xì)菌性病原菌的鑒定結(jié)果：采樣點(diǎn)1、3、4、5、6的葉片樣本均攜帶細(xì)菌性潰瘍病病原菌(圖2)。

圖2 春、夏、秋冬季感病園區(qū)樣本PsaF1/PsaR2菌落PCR擴(kuò)增圖Fig.2 Gel electrophoresis of colony PCR products of infected samples collected from orchards in spring, summer, autumn and winter using PsaF1/PsaR2 primers

2.3 真菌性病原菌的測(cè)序結(jié)果及預(yù)測(cè)病害

在各園區(qū)感病樣本上均分離到多種真菌(圖3),秋冬季、春季和夏季的具體菌株列表及各采樣點(diǎn)的預(yù)測(cè)病害見表2。

圖3 不同菌株的菌落及其孢子形態(tài)圖Fig.3 Morphology of colony and conidia of isolated strains

園區(qū)編號(hào)Orchard no.采樣季節(jié)Samplingseason菌株號(hào)Strainsno.NCBI登錄號(hào)Accession no.BLAST對(duì)應(yīng)最近似種屬Closest species最近似種屬登錄號(hào)Accession no.of theclosest species相似性/%Identity預(yù)測(cè)病害Predicteddisease1秋冬季LPS-1KX355167菜豆間座殼菌大豆變種Diaporthe phaseolorum var. sojaeJF4304891001秋冬季LPS-2KX355168淡色生赤殼菌Bionectria ochroleucaEU3261861002秋冬季LPS-3KX355169忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病2秋冬季LPS-4KX355170忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病3秋冬季LPS-5KX355171忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病3秋冬季LPS-6KX355172忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病3秋冬季LPS-7KX355173膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesKT390195100炭疽病4秋冬季LPS-8KX355174忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病4秋冬季LPS-9KX355175菜豆間座殼菌大豆變種Diaporthe phaseolorum var. sojaeJF4304891004秋冬季LPS-10KX355176新殼梭孢Neofusicoccum parvumKF923242100

續(xù)表2Table2(Continued)

園區(qū)編號(hào)Orchard no.采樣季節(jié)Samplingseason菌株號(hào)Strainsno.NCBI登錄號(hào)Accession no.BLAST對(duì)應(yīng)最近似種屬Closest species最近似種屬登錄號(hào)Accession no.of theclosest species相似性/%Identity預(yù)測(cè)病害Predicteddisease5秋冬季LPS-11KX355177忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病5秋冬季LPS-12KX355178忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病5秋冬季LPS-13KX355179忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病5秋冬季LPS-14KX355180藍(lán)莓間座殼菌Diaporthe hongkongensisNR_11184899軟腐病6秋冬季LPS-15KX355181新殼梭孢Neofusicoccum parvumFJ9048171006秋冬季LPS-16KX355182菜豆間座殼菌大豆變種Diaporthe phaseolorum var. sojaeJF4304891006秋冬季LPS-17KX355183小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis microsporaKR703275100軟腐病、灰斑病7秋冬季LPS-18KX355184膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesKU136388100炭疽病7秋冬季LPS-19KX355185互隔鏈格孢Alternaria alternataKT345696100軟腐病、褐斑病7秋冬季LPS-20KX355186芒果擬盤多毛孢Neopestalotiopsis egyptiacaKP9437471008秋冬季LPS-21KX355187蕓薹生鏈格孢Alternaria brassicicolaKU2935951008秋冬季LPS-22KX355188忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病9秋冬季LPS-23KX355189葡萄擬盤多毛孢Pestalotiopsis biciliataKT337374100軟腐病、灰斑病9秋冬季LPS-24KX355190互隔鏈格孢Alternaria alternataKT345696100軟腐病、褐斑病9秋冬季LPS-25KX355191稻黑孢Nigrospora oryzaeEU436680100黑斑病、褐斑病10A秋冬季LPS-26KX355192擬盤多毛孢菌Pestalotiopsis sp.JQ341110100軟腐病、灰斑病10A秋冬季LPS-27KX355193忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病10A秋冬季LPS-28KX355194尖頂炭角菌Xylaria apiculataKP1333309911秋冬季LPS-29KX355195忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病11秋冬季LPS-30KX355196忽視擬盤多毛孢Pestalotiopsis neglectaKT337391100軟腐病、灰斑病11秋冬季LPS-31KX355197菜豆間座殼菌大豆變種Diaporthe phaseolorum var. sojaeJF43048910011秋冬季LPS-32KX355198菜豆間座殼菌大豆變種Diaporthe phaseolorum var. sojaeJF4304891001春季LPS-33KX588102白囊耙齒菌Irpex lacteusKU844327971春季LPS-34KX588103木賊鐮刀菌Fusarium equisetiHQ33253210011春季LPS-35KX588104白囊耙齒菌Irpex lacteusJX3119249910C春季LPS-36KX588105白囊耙齒菌Irpex lacteusHQ33102810010B春季LPS-37KX588106細(xì)極鏈格孢Alternaria tenuissimaKF95114910010B春季LPS-38KX588107白囊耙齒菌Irpex lacteusJX3119249910B春季LPS-39KX588108白囊耙齒菌Irpex lacteusEU2735179910B春季LPS-40KX588109互隔鏈格孢Alternaria alternataKT19232999軟腐病、褐斑病6春季LPS-41KX588110白囊耙齒菌Irpex lacteusHQ331096986春季LPS-42KX588111白囊耙齒菌Irpex lacteusJX311924995夏季LPS-43MF379313菜豆間座殼菌大豆變種Diaporthe phaseolorum var. sojaeKX3551981005夏季LPS-44MF379314菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumKT951298100軟腐病5夏季LPS-45MF379315新殼梭孢Neofusicoccum parvumKX3551811005夏季LPS-46MF379316互隔鏈格孢Alternaria alternataKY977416100軟腐病、褐斑病5夏季LPS-47MF379317葡萄座腔菌Botryosphaeria dothideaKU686880100軟腐病6夏季LPS-48MF379318新殼梭孢Neofusicoccum parvumKX3551811006夏季LPS-49MF379319互隔鏈格孢Alternaria alternataKY977416100軟腐病、褐斑病22夏季LPS-50MF379320擬莖點(diǎn)霉Phomopsis sp.FJ03776899軟腐病22夏季LPS-51MF379321互隔鏈格孢Alternaria alternataKY977416100軟腐病、褐斑病22夏季LPS-52MF379322膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesKX355173100炭疽病22夏季LPS-53MF379323大豆擬莖點(diǎn)霉種腐病菌Phomopsis longicollaFJ75523699軟腐病7夏季LPS-54MF379324甜櫻間座殼菌Diaporthe eresFJ47813299軟腐病7夏季LPS-55MF379325互隔鏈格孢Alternaria alternataKY977416100軟腐病、褐斑病7夏季LPS-56MF379326桃擬莖點(diǎn)霉Phomopsis amygdaliGU133063100軟腐病7夏季LPS-57MF379327膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesJX258757100炭疽病7夏季LPS-58MF379328多主棒孢霉Corynespora cassiicolaKR3365461007夏季LPS-59MF379329菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumKP182395100軟腐病7夏季LPS-60MF379330新殼梭孢Neofusicoccum parvumKX3551811007夏季LPS-61MF379331新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopsis sp.KU25221910023夏季LPS-62MF379332菜豆間座殼菌大豆變種Diaporthe phaseolorum var. sojaeKX35519710023夏季LPS-63MF379333鹿角炭角菌Xylaria hypoxylonKF30634223夏季LPS-64MF379334菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumKX866879100軟腐病23夏季LPS-65MF379335膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesKT390189100炭疽病23夏季LPS-66MF379336菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumKP182395100軟腐病23夏季LPS-67MF379337擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis sp.KU25229899軟腐病、灰斑病23夏季LPS-68MF379338菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumMF185352100軟腐病24夏季LPS-69MF379339菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumKX866879100軟腐病24夏季LPS-70MF379340雙座盤殼菌屬Biscogniauxia sp.KJ542314100

續(xù)表2Table2(Continued)

園區(qū)編號(hào)Orchard no.采樣季節(jié)Samplingseason菌株號(hào)Strainsno.NCBI登錄號(hào)Accession no.BLAST對(duì)應(yīng)最近似種屬Closest species最近似種屬登錄號(hào)Accession no.of theclosest species相似性/%Identity預(yù)測(cè)病害Predicteddisease24夏季LPS-71MF379341膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesKT390189100炭疽病24夏季LPS-72MF379342葡萄座腔菌Botryosphaeria dothideaKY788311100軟腐病24夏季LPS-73MF379343博寧炭疽菌Colletotrichum boninenseMF07658510024夏季LPS-74MF379344互隔鏈格孢Alternaria alternataKY977416100軟腐病、褐斑病24夏季LPS-75MF379345鹿角炭角菌Xylaria hypoxylonKF30634210024夏季LPS-76MF379346菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumKX866879100軟腐病2夏季LPS-77MF379347大豆擬莖點(diǎn)霉種腐病菌Diaporthe longicollaMF125057100軟腐病2夏季LPS-78MF379348菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumKX866879100軟腐病2夏季LPS-79MF379349膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesKT390189100炭疽病2夏季LPS-80MF379350叢赤殼菌Nectria pseudotrichiaGU232860992夏季LPS-81MF379351炭角菌Xylaria bambusicolaGU300088992夏季LPS-82MF379352菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumKP182395100軟腐病1夏季LPS-83MF379353多主棒孢霉Corynespora cassiicolaKR3365461001夏季LPS-84MF379354楓香擬莖點(diǎn)霉Phomopsis liquidambariFJ47812499軟腐病1夏季LPS-85MF379355間座殼屬Diaporthe sp.EF42354999軟腐病1夏季LPS-86MF379356互隔鏈格孢Alternaria alternataKY977416100軟腐病、褐斑病1夏季LPS-87MF379357菜豆間座殼菌Diaporthe phaseolorumMF185352100軟腐病1夏季LPS-88MF379358間座殼屬Diaporthe sp.EF423549100軟腐病1夏季LPS-89MF379359葡萄座腔菌Botryosphaeria dothideaKY788311100軟腐病1夏季LPS-90MF379360橡膠擬莖點(diǎn)霉Phomopsis heveicolaKY379053100軟腐病1夏季LPS-91MF379361炭墊菌Nemania primoluteaEF026121100

圖4 不同菌株接種葉片和果實(shí)的癥狀Fig.4 Symptoms on kiwifruit leaves and fruits after inoculation

2.4 致病性驗(yàn)證

致病性試驗(yàn)結(jié)果表明,果實(shí)和葉片均在6 d左右發(fā)病,并在發(fā)病處重新分離到了原接種的菌株,完成了柯赫氏法則致病性檢測(cè)。結(jié)果顯示擬盤多毛孢和鏈格孢的菌株均可引起果實(shí)軟腐病;擬盤多毛孢菌株可引起灰斑病;膠孢炭疽菌會(huì)引起炭疽病;鏈格孢會(huì)導(dǎo)致褐斑病;稻黑孢會(huì)導(dǎo)致黑斑病和褐斑病。其他病原菌的致病性結(jié)果并不十分明顯,還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3 討論

獼猴桃病害的類型和發(fā)生程度受宿主生長(zhǎng)地域、生育期、品種抗性、氣候條件和土壤環(huán)境等因素影響。六盤水市獼猴桃種植園區(qū)普遍在海拔1 000 m以上,品種大部分為‘紅陽’。從檢測(cè)結(jié)果來看,采樣點(diǎn)1、3、4、5、6、10B、10C均已證實(shí)感染細(xì)菌性潰瘍病,其中采樣點(diǎn)5、6連續(xù)3次均發(fā)現(xiàn)潰瘍病。該病由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)引起。自2008年以來,細(xì)菌性潰瘍病在全球大規(guī)模暴發(fā),具有發(fā)生范圍廣、致病性強(qiáng)、傳播迅速、根除難度大等特點(diǎn),已經(jīng)成為獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素[4]。近年來,我國陜西、四川、安徽、湖南和河南等獼猴桃主要產(chǎn)區(qū)均出現(xiàn)大量感染潰瘍病的報(bào)告,且由于苗木遠(yuǎn)距離運(yùn)輸,該病在江蘇、浙江、廣西及貴州等獼猴桃新發(fā)展區(qū)域逐漸被發(fā)現(xiàn)。究其原因,近年來由于‘紅陽’品種的出園價(jià)格持續(xù)走高,各地區(qū)新發(fā)展園區(qū)均大量引進(jìn)‘紅陽’苗木。六盤水市的‘紅陽’獼猴桃苗木主要從四川省引進(jìn),然而四川部分園區(qū)已證實(shí)感染了潰瘍病,帶菌苗木的運(yùn)輸及栽培極大程度上加快了潰瘍病在六盤水的傳播。該病目前并無根治方法,只能運(yùn)用銅制劑、鏈霉素等進(jìn)行化學(xué)防治,以盡可能減輕癥狀,減少傳播。

獼猴桃果實(shí)軟腐病是近年來獼猴桃產(chǎn)業(yè)中最嚴(yán)重的真菌病害,在果實(shí)采收期間無明顯表征,貯藏期間才逐漸顯現(xiàn)病癥。目前已確定的獼猴桃果實(shí)軟腐病致病菌有葡萄座腔菌B.dothidea,擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.,擬莖點(diǎn)霉Phomopsissp.,互隔鏈格孢A.alternata等[5-10]。通過對(duì)分離到的菌株進(jìn)行分析(表2),六盤水市各采樣點(diǎn)均鑒定到以上致病菌,同時(shí)鑒定到間座殼菌(Diaporthesp.,擬莖點(diǎn)霉Phomopsissp.的有性態(tài)),由此可見六盤水市各園區(qū)內(nèi)潛伏的果實(shí)軟腐病病原菌種類很多,均需對(duì)軟腐病病原進(jìn)行重點(diǎn)防治,防止來年軟腐病造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

同時(shí),擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.被證實(shí)可引起獼猴桃的灰斑病[11],互隔鏈格孢A.alternata可引起獼猴桃的褐斑病[12],稻黑孢N.oryzae可引起獼猴桃的黑斑病和褐斑病[13]。由于在獼猴桃真菌病害發(fā)病初期,灰斑病與褐斑病等不能從表征上進(jìn)行有效區(qū)分,建議對(duì)兩種病害進(jìn)行綜合防治。采樣點(diǎn)3、7的秋冬季樣品和2、7、22、23、24夏季樣品鑒定出膠孢炭疽菌C.gloeosporioides,該菌已被證實(shí)會(huì)引起炭疽病[14]。

另外,部分分離到的病原菌菌株在致病性驗(yàn)證中,并未引起葉片或果實(shí)上明顯的感病癥狀,需進(jìn)一步鑒定及驗(yàn)證。

此次調(diào)查結(jié)果顯示,六盤水市獼猴桃秋冬季和夏季的主要病害有細(xì)菌性潰瘍病及真菌性軟腐病、褐斑病、灰斑病,其次是炭疽病和黑斑病,春季主要是潰瘍病,其次是真菌病害,相對(duì)其他季節(jié)輕微一些,與全國范圍的規(guī)律保持一致。其主要原因可能是六盤水市各園區(qū)在秋季收獲果實(shí)后都會(huì)采取相關(guān)措施進(jìn)行徹底的冬季清園,春季病情基數(shù)得到有效控制,隨著夏季溫度升高,病害再次暴發(fā)。

本文首次對(duì)六盤水市獼猴桃常見病害進(jìn)行了周年調(diào)查,確定了當(dāng)?shù)夭煌瑫r(shí)期獼猴桃上的主要病原菌,并對(duì)潛在可能發(fā)生的病害進(jìn)行了預(yù)測(cè),為各園區(qū)后期進(jìn)行有效的病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及綜合防治奠定了基礎(chǔ)。