海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

曹學(xué)仁, 車海彥, 羅大全

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所,農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, ?？?571101)

天然橡膠是我國(guó)四大戰(zhàn)略物資之一。炭疽病是橡膠樹(shù)上的一種重要葉部病害,該病于1906年在斯里蘭卡被首次報(bào)道,目前在亞洲和非洲等橡膠種植國(guó)廣泛發(fā)生[1]。該病害早期在我國(guó)只在苗圃和新植幼樹(shù)上少量發(fā)現(xiàn),自1962年首次在海南大豐農(nóng)場(chǎng)開(kāi)割膠樹(shù)上發(fā)現(xiàn)后,各植膠區(qū)陸續(xù)有其發(fā)生危害的報(bào)道[2-3]。近年來(lái)炭疽病的發(fā)生日趨嚴(yán)重,是農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)“兩病”春防工作的防治對(duì)象之一。

一直以來(lái)膠孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesPenz.被認(rèn)為是引起我國(guó)橡膠炭疽病的病原菌[4-5]。2010年李繼鋒等報(bào)道引起海南橡膠炭疽病的病原菌除膠孢炭疽菌外,還包括尖孢炭疽菌C.acutatumSimmonds[6]。隨著分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)C.gloeosporioides和C.acutatum均是復(fù)合種[7-8]。作者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),目前海南橡膠樹(shù)炭疽病病原以C.gloeosporioides復(fù)合種為主[9]。通過(guò)分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)一步表明,暹羅刺盤孢菌C.siamense是C.gloeosporioides復(fù)合種中的優(yōu)勢(shì)種。目前關(guān)于橡膠樹(shù)炭疽菌的研究主要集中在復(fù)合種及種的鑒定方面[5-6,10],尚未見(jiàn)關(guān)于其種內(nèi)的遺傳多樣性的研究報(bào)道。因此本研究對(duì)海南省橡膠樹(shù)C.siamense群體的遺傳結(jié)構(gòu)、群體遺傳多樣性及單倍型地理分布進(jìn)行了研究,從而為制定可持續(xù)控制該病害策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2017年4-8月,從海南保亭、儋州、?？凇偤：屯筒?個(gè)市縣的橡膠種植園中隨機(jī)采集炭疽病病葉,室內(nèi)進(jìn)行病原菌的分離和純化,經(jīng)形態(tài)和多基因分子鑒定,確定為暹羅刺盤孢菌C.siamense的菌株58個(gè),具體分布為:保亭12個(gè)、儋州10個(gè)、海口12個(gè)、瓊海15個(gè)和屯昌9個(gè)。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取

用滅菌的牙簽將在PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌絲刮下,采用TIANGEN新型植物基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取病原菌DNA,提取方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采用真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增ITS1、ITS2和5.8S rDNA全序列及18S rDNA和 28S rDNA的部分序列。PCR反應(yīng)體系(25 μL):12.5 μL TaKaRa PremixTaq,引物各1 μL(5 μmol/L),模板DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃變性4 min;95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min;4℃保存。

1.2.3 測(cè)序

PCR產(chǎn)物分別用正反向引物進(jìn)行雙向測(cè)序,以保證測(cè)序的準(zhǔn)確率。測(cè)序委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

原始雙向序列,采用DNAstar中Seqman拼接序列。應(yīng)用MEGA version 6.0[11]對(duì)拼接序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用DnaSP 5.0[12]計(jì)算多基因片段組合序列的標(biāo)準(zhǔn)多樣性指數(shù),如單倍型數(shù)H(number of haplotypes)、單倍型多樣性Hd(haplotype diversity)、核苷酸多樣性Pi(nucleotide diversity),并進(jìn)行Tajima’sD中性檢驗(yàn),以及繪制核酸錯(cuò)配分布圖(mismatch distribution of nucleotide)等。使用TCS1.21[13]構(gòu)建暹羅刺盤孢菌單倍型的網(wǎng)絡(luò)圖。采用Arlequin 3.5.2.2[14]軟件進(jìn)行分子變異分析(analysis of molecular variance, AMOVA)。采用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),使用 Kimura 雙參數(shù)模型,構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(N-J tree),利用自展法(bootstrap,1 000 次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌單倍型地理分布及其多樣性

利用ITS通用引物ITS1/ITS4對(duì)海南58個(gè)橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌C.siamense擴(kuò)增、測(cè)序、拼接和序列比對(duì)后,得到的ITS序列長(zhǎng)度為591 bp,核苷酸組成分析結(jié)果表明:堿基A、T、G、C的平均含量分別為24.10%、24.24%、26.47%和25.2%,A+T含量為48.34%,G+C含量為51.66%。共發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)10個(gè),其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)8個(gè),單堿基變異位點(diǎn)2個(gè)。58條ITS序列共檢測(cè)到11種單倍型(haplotype,H)(表1),其中單倍型H11包含樣品數(shù)最多，達(dá)16個(gè),且在5個(gè)市(縣)均有分布,其次為單倍型H4,有12個(gè)樣品在4個(gè)市(縣)有分布,說(shuō)明各地理種群間存在頻繁的基因交流。從地區(qū)來(lái)看,海口單倍型最多,為7種;瓊海最少,為4種;保亭、儋州和屯昌分別有5種、6種和5種。保亭和儋州有自己獨(dú)特的單倍型,其中保亭獨(dú)特的單倍型有2種,說(shuō)明各地區(qū)的病原菌存在一定的遺傳分化現(xiàn)象。

海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌不同地理種群的單倍型多樣性在0.724～0.889之間,其中儋州種群的單倍型多樣性最高,為0.889;瓊海種群的單倍型多樣性最低,為0.724。核苷酸多樣性(Pi)也處于較高的水平,在0.002 55～0.003 77之間(表1),結(jié)果表明,海南地區(qū)橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌具有豐富的遺傳多樣性。

表1海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌樣品的分布及單倍型多樣性

Table1DistributionsandhaplotypediversityofColletotrichumsiamensesamplesfromrubbertreeinHainan

地區(qū)Site樣品數(shù)Number單倍型(數(shù)量)Haplotype (Number)單倍型多樣性Haplotype diversity核苷酸多樣性Nucleotide diversity保亭 Baoting12H1(4);H3(3);H7(1);H9(1);H11(3)0.8180.002 93儋州 Danzhou10H2(3);H4(2);H5(2);H6(1);H8(1);H11(1)0.8890.003 77?？?Haikou12H1(1);H2(1);H3(1);H4(4);H6(1);H10(1);H11(3)0.8640.003 60瓊海 Qionghai15H4(2);H5(4);H6(2);H11(7)0.7240.002 55屯昌 Tunchang9H1(1);H2(1);H4(4);H10(1);H11(2)0.8060.003 30合計(jì) Total58H1(6);H2(5);H3(4);H4(12);H5(6);H6(4);H7(1);H8(1);H9(1);H10(2);H11(16)0.8550.003 45

2.2 單倍型網(wǎng)絡(luò)分析及種群擴(kuò)張分析

利用TCS軟件繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(見(jiàn)圖1),可以看出病原菌發(fā)生了一定的遺傳分化,各單倍型并沒(méi)有依采樣地點(diǎn)形成各自的分支,而是呈現(xiàn)一個(gè)非典型星狀的發(fā)散圖。單倍型H11處于輻射中心,推測(cè)為原始單倍型。此外,由核苷酸不配對(duì)分布圖(圖2)可以看出,分布曲線呈雙峰形式。另外Tajima’s D中性檢驗(yàn)結(jié)果為-0.164 55,無(wú)顯著性,這些結(jié)果均表明海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌種群歷史上未經(jīng)歷明顯的擴(kuò)張,其種群大小整體保持穩(wěn)定。

圖1 海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Parsimony network of the haplotypes of Colletotrichum siamense from rubber tree in Hainan

2.3 遺傳分化分析

58個(gè)菌株ITS序列數(shù)據(jù)的AMOVA分析結(jié)果表明,海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌種群變異主要發(fā)生在種群內(nèi),占總變異的93.9%;而群體間遺傳差異較小,占總變異的6.1%,說(shuō)明病菌群體間基因交流頻繁。種群內(nèi)的遺傳分化指數(shù)(Fst)值為0.061,說(shuō)明海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌群體產(chǎn)生了遺傳分化,這和單倍型的簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果一致。

圖2 海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌群體核苷酸不配對(duì)分布Fig.2 Mismatch distribution of Colletotrichum siamense from rubber tree in Hainan

不同地理種群間的遺傳分化Fst見(jiàn)表3。保亭病菌樣品與其他四市(縣)之間的遺傳分化較大,Fst在0.215 74～0.324 8之間;瓊海病菌樣品與除保亭外的其他三市(縣)之間的Fst都小于0.05,說(shuō)明這些群體間遺傳分化很弱,基因交流十分頻繁;?？谂c儋州、?？谂c屯昌之間的Fst均小于0.1,表明這些種群間存在一定程度的遺傳分化。

表2海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌種群內(nèi)和種群間的分子變異分析

Table2AMOVAanalysisofgeneticvariationwithinandamongpopulationsofColletotrichumsiamensefromrubbertreeinHainan

變異來(lái)源Source自由度df平方和Sum of squares變異成分Variance components總變異百分比/%Percentage of variation統(tǒng)計(jì)Stat數(shù)值Value概率Prob群體間 Among populations42.8400.026 39 Va6.1群體內(nèi) Within populations5321.5390.406 39 Vb93.9Fst0.0610.023合計(jì) Total5724.3790.432 78

表3海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌不同地理種群間遺傳分化值

Table3PairwiseFstvaluebetweengeographicalpopulationofColletotrichumsiamensefromrubbertreeinHainan

群體Population保亭Baoting儋州Danzhou?？贖aikou瓊海Qionghai屯昌Tunchang保亭Baoting0 儋州Danzhou0.260 090 ?？贖aikou0.215 74-0.064 270 瓊海Qionghai0.324 80-0.042 59-0.035 150 屯昌Tunchang0.317 12-0.065 51-0.083 01-0.023 620

2.4 基于 ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,來(lái)自同一地區(qū)的單倍型并沒(méi)有聚在一個(gè)分支內(nèi),而是分布在系統(tǒng)樹(shù)的不同分支中,不同地區(qū)菌株的單倍型交叉共存,說(shuō)明其間存在有效的基因流,沒(méi)有呈現(xiàn)出明顯的地理差異,部分地理種群雖然具有獨(dú)特的單倍型,但各單倍型的差異不大。

圖3 采用鄰接法構(gòu)建的基于ITS序列的海南橡膠樹(shù) 暹羅刺盤孢菌系統(tǒng)樹(shù)Fig.3 Neighbour-joining tree based on ITS sequences of Colletotrichum siamense from rubber tree in Hainan

3 討論

遺傳多樣性是評(píng)價(jià)一個(gè)物種的進(jìn)化潛能和抵御自然界各種生存壓力的重要遺傳學(xué)指標(biāo)。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed spacer)承受的選擇壓力較小,進(jìn)化速率快,能提供比較豐富的核苷酸變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn),已經(jīng)證實(shí)可用于研究真菌種內(nèi)遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu),如李河等[15]利用ITS 序列對(duì)引起油茶炭疽病的膠孢炭疽菌種群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,朱丹雪等[16]利用ITS 序列研究了果生刺盤孢菌C.fructicola的群體遺傳結(jié)構(gòu)。本研究利用 ITS 序列,分析了海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌的種群遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病菌單倍型多樣性較豐富,病菌種群歷史上并沒(méi)有發(fā)生顯著的種群擴(kuò)張,來(lái)自同一個(gè)地區(qū)病菌的單倍型未能聚在一起,這與海南省油茶及其他寄主植物果生刺盤孢菌群體和暹羅炭疽菌群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果一致[17-18]。

11種單倍型中,除了3種單倍型由于只有一個(gè)樣品而僅在一個(gè)市(縣)分布外,其余8種單倍型都在2個(gè)或2個(gè)以上市(縣)有分布,說(shuō)明病菌在各地理種群間存在頻繁的基因交流。而遺傳分化指數(shù)結(jié)果說(shuō)明海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤孢菌群體產(chǎn)生了一定的遺傳分化,其中以保亭病菌樣品與其他四市(縣)之間的遺傳分化較大,這可能與保亭位于海南省南部,有五指山山脈與其他4市(縣)隔離,環(huán)境氣候條件與其他市(縣)區(qū)別較大。另外暹羅炭疽菌最早在泰國(guó)的咖啡漿果上發(fā)現(xiàn)[19],隨后在草莓、油茶、可可、番木瓜、辣椒、葡萄等多種寄主植物上均有發(fā)現(xiàn)[8],而有研究發(fā)現(xiàn)不同寄主種群間的暹羅炭疽菌有一定的遺傳分化[18],而海南不同地區(qū)作物種植存在一定差異,病菌為了適應(yīng)寄主而產(chǎn)生變異,從而導(dǎo)致病菌具有豐富的遺傳多樣性。