柱前衍生化HPLC法測定玉屏風復合多糖的單糖組成

王少杰， 巴 娟， 張勇軍， 鄧 樺， 蒲文珺， 楊 鴻

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院， 廣東 佛山 528231)

中藥多糖具有增強免疫力、抗應激、抗病毒等廣泛的生物學活性，已在畜牧獸醫(yī)領域得到廣泛的應用，也是新獸藥研究的熱點。玉屏風散出自元·朱丹溪的《丹溪心法》，是中醫(yī)扶正固本的代表方劑，由黃芪、白術、防風三味藥物組成，YPF-P為玉屏風散的有效部位群，研究表明,玉屏風散及其多糖對免疫系統(tǒng)有廣泛的調(diào)節(jié)作用[1-3]，在獸醫(yī)臨床有較好的應用前景。

目前獸用中藥多糖的質量控制標準不完善，往往僅檢測總糖含量，致使一些假、劣的多糖產(chǎn)品屢屢出現(xiàn)。多糖所具有的藥理活性及其單糖組成是密切相關的，因此在檢測總糖含量時還需對其單糖組成進行定性分析[4-7]。由于多糖和單糖都不具有紫外吸收，無法直接對其進行測定[8]，因此本試驗先對YPF-P進行水解和衍生化處理，再采用高效液相色譜法(HPLC)分析其單糖組成及其物質量比，為YPF-P質控標準的制定進行探索性研究，也為獸用中藥多糖的質量控制研究提供借鑒。

1 材料

1.1 藥品 中藥黃芪、白術、防風，購自北京同仁堂藥店佛山分店；D-甘露糖(批號：140651-201403)、鼠李糖(批號：111683-201502)、D-核糖(批號：140668-201302)、D-半乳糖醛酸(批號：111646-200301)、阿拉伯糖(批號：1506-200001)。對照品購自中國食品藥品檢定研究院；D-葡萄糖(批號：201705)，D-半乳糖(批號：201705)對照品，購自上海瑞楚生物科技有限公司。

1.2 試劑 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、無水乙醇、苯酚、硫酸、三氟乙酸(TFA)、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純。

1.3 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀；雷磁PHS-3C pH計；LABCONCO FreeZone?真空冷凍干燥機；湘儀H1650-W臺式高速離心機；UV-6000型紫外/可見分光光度計；HH-8恒溫水浴鍋；予華RE-201D旋轉蒸發(fā)儀。

2 方法

2.1 YPF-P的制備及含量測定[9]將黃芪、白術、防風按3∶1∶1的質量配方。采用L9(34)正交試驗設計優(yōu)化水提醇沉淀的提取工藝，將提取的粗多糖經(jīng)AB-8大孔樹脂純化濃縮，真空冷凍干燥即得精制多糖，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

2.2 YPF-P水解 稱取50 mg精制多糖兩份，置于兩個10 mL密封試管中加入2 mol/L的TFA溶液2 mL,97 ℃水浴8 h，水解結束放涼后用4 mol/L NaOH溶液中和至中性，離心取上清即得。

2.3 混合單糖標準品與YPF-P水解樣品的衍生化 分別稱取D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、阿拉伯糖對照品各5 mg，定容于25 mL容量瓶中即得混合單糖標準品。取該溶液100 μL與0.5 mol/L PMP 甲醇溶液50 μL及0.3 mol/L NaOH 溶液50 μL混合，充分振搖，水浴條件下反應30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 50 μL進行中和，加入1 mL 氯仿萃取，離心，棄去有機層，重復萃取3 次，得上層水液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，備用[10]。取精制YPF-P水解樣品100 μL采用同樣的方法進行衍生化處理即得。

2.4 色譜條件與專屬性試驗 色譜柱：Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動相：磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.9)-乙腈(85∶15)；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL，檢測波長254 nm。分別取對照品溶液和供試品溶液進樣測定，各色譜峰得到良好的分離。

2.5 方法學考察 精密度試驗：取混合單糖標準品溶液，衍生化后連續(xù)進樣6次，以峰面積的RSD值考察儀器精密度；重復性試驗：取YPF-P的衍生化產(chǎn)物連續(xù)6次進樣測定；穩(wěn)定性試驗：取YPF-P的衍生化產(chǎn)物分別在0、2、4、8、16、24 h進樣。回收率試驗：在樣品中添加相當于樣品含量一半的100%、120%和150%混合單糖標準品，配成3個質量濃度的溶液，進行測定。

2.6 線性考察 混合單糖標準品分別進樣1、2、4、6、8、10 μL，用峰面積對各單糖的質量濃度回歸。

2.7 各單糖的物質的量比[11]計算方法：按式(1)、(2)計算其中兩種單糖間的校正因子f1/2和樣品中這兩種單糖的比例R1/2。

f1/2=(A2/m2)/(A1/m1)

(1)

A1、A2 分別為混合對照品溶液中單糖1、2 的峰面積，m1、m2 分別為混合對照品溶液中單糖1、2 的質量濃度。

(2)

3 結果

3.1 YPF-P制備和含量測定 最佳提取條件為：料液比1∶16、浸提時間1.5 h、浸提溫度90 ℃、提取次數(shù)3次，之后抽濾、濃縮提取液，無水乙醇沉淀濃縮液12 h，取沉淀物經(jīng)真空干燥，得玉屏風復合粗多糖。經(jīng)AB-8大孔樹脂純化的YPF-P含量可達93%以上。

3.2 方法學考察 精密度試驗：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為1.13%、0.90%、0.49%、0.70%、0.57%、1.53%、1.52%。

重復性試驗：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的RSD值分別為0.65%、1.36%、1.39%、1.21%、1.20%、1.12%、0.60%。

穩(wěn)定性試驗：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為0.73%、0.78%、1.10%、0.89%、1.17%、1.11%、0.70%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗：計算得D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分別為101.4%，98.9%，99.7%，98.7%，98.3%，114.4%，110.0%；RSD值為0.29%，0.24%，0.20%，0.92%，0.41%，0.72%，1.86%。

3.3 線性考察 用峰面積對混合單糖標準品中各單糖的質量濃度回歸，線性結果見表1。

表1 單糖標準曲線方程

3.4 單糖對照品與YPF-P的HPLC分析色譜圖 將混合單糖對照品溶液與YPF-P水解產(chǎn)物分別衍生化后進行HPLC分析，通過單糖對照品圖譜得出結果：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的衍生化物分別在24.27、29.68、33.29、36.96、47.28、52.52、56.64 min左右出現(xiàn)吸收峰，見圖1；對比YPF-P圖譜，在相同的位置也出現(xiàn)的對應吸收峰，只是峰的大小有所不同?？梢源_定YPF-P由D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖7種單糖組成，見圖2。

圖1 單糖對照品溶液HPLC色譜圖

1:D-甘露糖； 2:D-核糖； 3:鼠李糖； 4:D-半乳糖醛酸；5:D-葡萄糖； 6:D-半乳糖； 7:阿拉伯糖

圖2 YPF-PHPLC色譜圖

1：D-甘露糖； 2：D-核糖； 3：鼠李糖； 4：D-半乳糖醛酸；5：D-葡萄糖； 6：D-半乳糖； 7：阿拉伯糖

3.5 YPF-P中各單糖的物質的量比 通過計算得出YPF-P中D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物質的量比為4.64∶1∶5.88∶2.40∶120∶42.9∶69.5，見表2。

表2 YPF-P中各單糖的物質的量比計算結果

4 討論

開展獸用中藥多糖質量控制的研究，制定國家或行業(yè)的質量標準，是創(chuàng)制新型多糖藥物或飼料添加劑的重要前提。由于多糖分子量相對較大，結構復雜，使多糖的定性和定量檢測成為多糖類新藥研發(fā)中的瓶頸問題。多糖的常規(guī)分離法包括提取、除脂、脫色、除蛋白、醇柱分離純化、透析等基本步驟[12]，處理過程繁瑣復雜。本試驗采用AB-8大孔樹脂對粗多糖溶液進行分離，提高了分離效率；采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法分析其單糖組成及其物質量比，解決了多糖和單糖不具有紫外線吸收，無法直接對其進行測定的問題。試驗旨在開展YPF-P的質量控制研究，摸索出快捷、有效質控方法，為YPF-P新獸用制劑的創(chuàng)制提供重要的基礎數(shù)據(jù)，也為多糖質量控制方法研究提供參考和借鑒。

試驗采用L9(34)正交試驗設計優(yōu)化水提醇沉淀的提取工藝，經(jīng)AB-8大孔樹脂對玉屏風粗多糖進行純化，使得YPF-P的含量達到93%以上。

對比單糖混合對照品圖譜與YPF-P圖譜(見圖1、2)，可以確定YPF-P由D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖7種單糖組成。研究表明，在單糖組成的定量分析中，采用只求單糖間的物質的量比的方法，而并不需要確定各單糖的具體質量[13]。本試驗得出YPF-P中D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物質的量比為4.64∶1∶5.88∶2.40∶120∶42.9∶69.5，明確了多糖中各單糖的組分，該結果對YPF-P質量標準的制定有重要意義。

在用高效液相色譜法分析多糖組成及其含量時，一般采用凝膠色譜柱與示差折光檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器等儀器，這些方法不僅靈敏度低、基線噪音大、柱溫對結果影響較大、測定過程中易發(fā)生單糖轉化并且這些儀器與色譜柱價格高昂。本試驗首次對方劑復合多糖進行單糖組成測定，建立的PMP柱前衍生化-高效液相色譜法分析YPF-P的方法靈敏度高、樣品用量少、穩(wěn)定性好、方法準確可靠，能夠很好地分離測定YPF-P的各單糖組分。