MiRNAs作為膽管癌診斷標(biāo)志物的Meta分析

金 巍，韓 濤，洪 欣，孫大軍，趙浩民

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院血管外科，長春 130033)

膽管癌在肝膽系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞癌，目前根治性切除術(shù)是其首要治療方法，但因早期缺乏有效的診斷方法，癥狀體征不明顯，大部分患者初次就診時(shí)腫瘤就已發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后差、病死率高，5年生存率僅5%～10%[1-2]。微RNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于真核生物的小分子RNA，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。目前已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，miRNAs對(duì)膽管癌的早期診斷具有潛在價(jià)值，但因多數(shù)研究樣本量較小且樣品的來源、檢測方法不同等而導(dǎo)致研究結(jié)果不完全一致。為此，采用Meta分析的方法，定量綜合統(tǒng)計(jì)，以全面客觀地評(píng)價(jià)miRNAs在膽管癌早期診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1檢索策略 系統(tǒng)全面地檢索了Pubmed、Web of Science、Cochrane Library、中國知網(wǎng)、萬方和維普等數(shù)據(jù)庫，檢索語言為中、英文，收集所有關(guān)于miRNA表達(dá)與膽管癌診斷相關(guān)的文獻(xiàn)，且不限制文獻(xiàn)發(fā)表時(shí)間。中文檢索關(guān)鍵詞為“膽管癌”“微小RNA”“microRNA”和“診斷”； 英文檢索詞為“cholangiocarcinoma” “microRNA” 和“diagnosis”。此外，為避免檢索不全面，手動(dòng)檢索相關(guān)文章的參考文獻(xiàn)。

1.2文獻(xiàn)的納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)文獻(xiàn)為原始研究；(2)研究內(nèi)容涉及miRNA表達(dá)對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值；(3)文中有充分的數(shù)據(jù)能夠直接或間接獲得miRNA診斷膽管癌的靈敏度和特異度；(4)當(dāng)存在來自同一人群的研究時(shí)，選擇納入人群最多或時(shí)間最近的文章。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)綜述、會(huì)議報(bào)道、評(píng)論、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；(2)無法得到完整數(shù)據(jù)，不能構(gòu)建診斷分析的2×2表格；(3)語言非中、英文。

1.3數(shù)據(jù)提取 根據(jù)事先制訂好的納入排除標(biāo)準(zhǔn)，兩名研究者各自獨(dú)立地篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)文獻(xiàn)，若有分歧，則由第3位研究者評(píng)估后做出決斷。確定納入文獻(xiàn)后，兩名研究者各自獨(dú)立地分別從每一篇參考文獻(xiàn)中提取以下信息：第一作者姓名、文章發(fā)表年份、國家、種族、樣本類型、檢測方法、病例組和對(duì)照組的樣本量、靈敏度和特異度。

1.4質(zhì)量評(píng)價(jià) 根據(jù)診斷試驗(yàn)文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的14個(gè)條目(QUADAS)[3]，對(duì)納入的每篇文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。每個(gè)條目的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)均包含“是”“否”和“不清楚”。“是”表示達(dá)到此條目標(biāo)準(zhǔn)，記1分；“否”表示未達(dá)到此條目標(biāo)準(zhǔn)，不得分，記0分；“不清楚”表示無法從原文獻(xiàn)中獲得此條目足夠信息，記0.5分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本篇文章采用Meta-Disc 1.4和Stata 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。作為診斷型的Meta分析，本文的評(píng)價(jià)指標(biāo)有合并的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷比值比及其相應(yīng)的95%置信區(qū)間，同時(shí)繪制合并受試者工作特征(SROC)曲線并計(jì)算曲線下面積(AUC)，AUC值越接近1，說明診斷的效能越高。納入的文獻(xiàn)中各研究間存在較大的異質(zhì)性是Meta分析中較常見的問題，而異質(zhì)性檢驗(yàn)包括閾值效應(yīng)和非閾值效應(yīng)檢驗(yàn)。通過繪制SROC曲線，以及計(jì)算靈敏度、1-特異度對(duì)數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)來檢驗(yàn)本研究是否存在閾值效應(yīng)。若異質(zhì)性是由非閾值效應(yīng)引起的，則通過I2來評(píng)估異質(zhì)性的大小，若I2>50%且P<0.05,認(rèn)為各研究間存在較大的異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并通過做亞組分析來探討異質(zhì)性的來源。同時(shí)，通過做Deek′s 漏斗圖不對(duì)稱檢驗(yàn)，來判斷和評(píng)估本研究是否存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié) 果

2.1文獻(xiàn)檢索情況 初步檢索共篩出392篇文獻(xiàn)，其中在Pubmed數(shù)據(jù)庫檢索出161篇，在Web of Science數(shù)據(jù)庫檢索到129篇，在Cochrane Library檢出2篇，中國知網(wǎng)檢出29篇，萬方數(shù)據(jù)庫檢出44篇，維普數(shù)據(jù)庫檢索到27篇，合計(jì)392篇，復(fù)篩后共納入11篇文獻(xiàn)，其中英文9篇，中文2篇。文獻(xiàn)檢索流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程圖

表1 納入文獻(xiàn)的基本信息和質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2納入文獻(xiàn)的基本信息和質(zhì)量評(píng)價(jià) 納入文獻(xiàn)的基本特征和質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見表1。11篇文獻(xiàn)共包括819例研究對(duì)象，其中病例組共439例，對(duì)照組共380例。

2.3發(fā)表偏倚評(píng)估 Deek′ s檢驗(yàn)用于評(píng)估本研究是否存在發(fā)表偏倚，在本研究中，漏斗圖斜率系數(shù)為0.59，P=0.570，本篇Meta分析納入的文獻(xiàn)不存在發(fā)表偏倚，見圖2。

圖2 納入文獻(xiàn)的Deek′ s 漏斗圖

2.4閾值效應(yīng) 本篇Meta分析通過繪制SROC曲線，以及計(jì)算靈敏度、1-特異度對(duì)數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)來檢驗(yàn)本研究是否存在閾值效應(yīng)，SROC曲線不成肩臂狀分布；Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.025，P=0.940，不存在閾值效應(yīng)(圖3)。

圖3 MiRNAs 診斷膽管癌的 SROC曲線

2.5合并分析結(jié)果 初步合并靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比和診斷比值比，上述指標(biāo)的I2值分別為49.6%、66.0%、60.1%、41.0%和40.1%，同時(shí)每項(xiàng)研究的估計(jì)值與合并效應(yīng)值不呈同一條直線，納入本篇Meta分析的各研究間存在著非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。分析結(jié)果顯示miRNAs診斷膽管癌的靈敏度為0.86[95%CI(0.80,0.87)]，特異度為0.85[95%CI(0.81,0.89)],陽性似然比為4.83[95%CI(3.23,7.31)],陰性似然比為0.22[95%CI(0.16，0.29)]，診斷比值比為27.49[95%CI(15.30，49.38)]，見圖4～8。SROC曲線結(jié)果顯示，本研究的AUC值為0.908 2。

圖4 MiRNAs對(duì)膽管癌的診斷靈敏度森林圖

圖5 MiRNAs對(duì)膽管癌的診斷特異度森林圖

圖6 MiRNAs對(duì)膽管癌診斷的陽性似然比森林圖

圖7 MiRNAs對(duì)膽管癌診斷的陰性似然比森林圖

圖8 MiRNAs對(duì)膽管癌診斷比值比森林圖

2.6亞組分析 由于納入的研究間存在由非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，進(jìn)一步按不同種族和標(biāo)本類型進(jìn)行分組做亞組分析。按種族分組，其中2篇文章[4,11]中的3個(gè)研究的實(shí)施地點(diǎn)和研究人群分別來自美國、德國，屬于白色人種(高加索人種)，其余9個(gè)研究[5-10,12-14]分別來自中國、日本和泰國，屬于黃色人種。采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，不同種族的各診斷指標(biāo)合并值見表2。按標(biāo)本類型分組，其中4個(gè)研究[8-9,11-12]的樣本來自血清，2個(gè)研究[13-14]的樣本來自血漿，1個(gè)研究[10]的樣本來自尿液，2個(gè)研究[5,11]的樣本來自膽汁，3個(gè)研究[4,6-7]的樣本是組織來源。采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，不同樣本類型的各診斷指標(biāo)合并值見表2。

表2 亞組分析結(jié)果

3 討 論

膽管癌起病隱匿，惡性程度高，一旦發(fā)現(xiàn)多為中晚期，轉(zhuǎn)移早、手術(shù)切除率低，且預(yù)后差。糖蛋白抗原CA19-9是目前診斷膽管癌常用的血清學(xué)指標(biāo)，但其特異性和靈敏度欠佳[8]。因此，如何早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和治療已成為膽管癌研究的重點(diǎn)。近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛存在于正常人和患者的體液、組織中，且不同類型的腫瘤，miRNAs的表達(dá)譜亦有特異性變化[15]。目前，已有Meta分析系統(tǒng)研究了miRNAs對(duì)胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等的診斷價(jià)值，但尚無miRNAs對(duì)膽管癌診斷價(jià)值的Meta分析。本研究筆者全面系統(tǒng)地檢索相關(guān)文獻(xiàn)，采用Meta分析的方法評(píng)估了miRNAs對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值。

本篇文章共納入9篇英文和2篇中文，膽管癌患者共439例，對(duì)照組共380例。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，miRNAs對(duì)膽管癌診斷的合并靈敏度和特異度分別為0.83[95%CI(0.80,0.87)]和0.85[95%CI(0.81,0.89)],合并后的診斷比值比為27.49[95%CI(15.30，49.38)]，AUC值為0.908 2，以上結(jié)果顯示miRNAs診斷膽管癌的靈敏度和特異度均大于0.80，且AUC值大于0.90，提示miRNAs作為膽管癌早期診斷的生物標(biāo)志物具有較高的性能。經(jīng)檢驗(yàn)，本研究不存在閾值效應(yīng)，但存在由非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，為進(jìn)一步分析異質(zhì)性來源，分別以種族和檢測樣本類型為分組依據(jù)，對(duì)納入的11篇文獻(xiàn)進(jìn)行了亞組分析。亞組分析結(jié)果顯示，miRNAs對(duì)白種人膽管癌診斷的靈敏度為0.773，低于黃種人(0.845)，但特異度為0.927，高于黃種人(0.823)，診斷比值比為35.503,高于黃種人(26.318)，提示miRNAs檢測白種人膽管癌的早期診斷價(jià)值高于黃種人。樣本類型的亞組分析結(jié)果顯示，組織來源的診斷比值比最高，為89.595，提示miRNAs作為膽管癌的生物標(biāo)志物時(shí)，組織的診斷價(jià)值優(yōu)于血清(33.802)、血漿(29.956)、膽汁(25.340)，但在亞組分析結(jié)果中，組織來源的3個(gè)研究合并診斷比值比的I2高達(dá)81.8%，其他樣本來源的研究診斷比值比I2均為0，結(jié)果表明，在本研究中，由非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性主要來源于以組織標(biāo)本為研究對(duì)象的3篇文章[4,6-7]，提示組織中miRNAs檢測的穩(wěn)定性較差。同時(shí)，考慮臨床操作的復(fù)雜性、有無創(chuàng)傷性和患者的痛苦程度，認(rèn)為檢測人體血液標(biāo)本中miRNAs的表達(dá)水平更具有實(shí)際意義。

本研究力求嚴(yán)謹(jǐn)、無誤，但仍存在以下不足和缺陷：(1) 由于語言限制，本研究檢索的文章僅限于中、英文，且納入的中文文獻(xiàn)僅2篇，雖然發(fā)表偏倚檢驗(yàn)顯示本研究不存在發(fā)表偏倚，但由于能力有限，未檢索其他語言類型的文章，導(dǎo)致納入文獻(xiàn)尚不全面；(2)由于單個(gè)miRNA對(duì)膽管癌診斷價(jià)值的原始研究數(shù)量較少，本篇Meta分析納入的11篇文章中，miRNAs的類型較分散，不存在針對(duì)某個(gè)特異性的miRNA對(duì)膽管癌診斷價(jià)值的3個(gè)及3個(gè)以上研究，因而無法對(duì)某一個(gè)miRNA的診斷效能下結(jié)論，也就無法給出某個(gè)特定miRNA對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值結(jié)果。因而進(jìn)一步的大樣本研究和尋找某個(gè)特異性的miRNA將是未來研究的方向和重點(diǎn)。

綜上所述，miRNAs診斷膽管癌具有較高的靈敏度和特異度，其對(duì)白種人的診斷價(jià)值高于黃種人，就臨床意義而言，血液標(biāo)本中的miRNAs在膽管癌的早期診斷方面更具臨床應(yīng)用前景。