多項腫瘤標志物聯(lián)合檢測模型在肺癌診斷中的應用價值

張海晨，王 浩，宋云霄，馬 進

（1. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 200031；2.江西省精神病院檢驗科，江西 南昌 330029；3. 上海交通大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，上海 200025）

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。50年以來，肺癌5年生存率僅提升了4%，其主要原因是檢出滯后，而及早診斷和治療可顯著提高患者的生存率[1]。腫瘤標志物可用于腫瘤的篩查、診斷和預后判斷等，但單個腫瘤標志物的敏感性或特異性不高，難以滿足臨床要求，因此臨床實踐中提倡多腫瘤標志物聯(lián)合檢測，以提高診斷敏感性和特異性。目前，用于肺癌檢測的腫瘤標志物主要有糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）、腫瘤胚胎抗原、分化抗原和增生抗原等。盡管腫瘤標志物在腫瘤的診斷、療效評價和隨訪觀察方面價值巨大，但臨床上有大量腫瘤標志物檢測被不當使用，從而造成醫(yī)療資源的巨大浪費。合理、有效地應用這些腫瘤標志物，不僅可提高檢測的敏感性和特異性，也可避免過度醫(yī)療導致的資源浪費。為此，本研究收集了肺癌患者的多項腫瘤標志物檢測結(jié)果，運用統(tǒng)計學方法，建立多腫瘤標志物聯(lián)合檢測模型，為臨床檢驗策略優(yōu)化提供一種可行方案。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年1月—2015年12月上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院和上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院收治的，經(jīng)細胞學或組織病理學檢查確診為原發(fā)性肺癌（primary lung cancer，PLC）的患者318例，其中男216例、女102例，年齡36～92歲，從中隨機選取280例（男187例，女93例）作為PLC組，其他38例患者用于驗證運算。選取同期上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院和上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院肺良性疾?。╞enign pulmonary disease，BPD）患者505例，其中男327例、女178例，年齡16～106歲，從中隨機選取455例患者（男302例，女153例）作為陰性對照，其他50例患者用于驗證運算。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集所有對象空腹靜脈血，2 h內(nèi)離心分離血清。在24 h內(nèi)進行檢測的樣本冷藏（2～8 ℃）保存，24 h內(nèi)無法測定的樣本冷凍（-20℃及以下）保存，不能反復凍融，冷凍保存的樣本最多保存6個月。血清樣本量不少于5 mL。

1.2.2 腫瘤標志物檢測 甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、CA125、CA15-3、CA19-9、細胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA 21-1）、CA72-4、鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）采用cobas e411全自動電化學發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發(fā)光法）檢測。腫瘤特異性生長因子（tumor specific growth factor，TSGF）采用酶法檢測，試劑盒購自廣州科方生物技術股份有限公司，檢測儀器為ADVIA 2400全自動生化分析儀（德國西門子公司）。CA50和CA242采用MAGLUMI 800全自動化學發(fā)光分析儀（深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程股份有限公司）及配套試劑（化學發(fā)光免疫分析法）檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov-Smirnov法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。正態(tài)分布資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析。采用Medcalc v11軟件繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）、敏感性、特異性、陽性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、陰性似然比（negative likelihood ratio，-LR）、Youden指數(shù)、最佳臨界值等參數(shù)。AUC比較采用Z檢驗，AUC＜0.5時無診斷價值，0.5～0.7時診斷價值較低，0.7～0.9時診斷價值中等，＞0.9時診斷價值較高。應用探索性因子分析（exploratory factor analysis，EFA）提取潛在公共因子，對同一因子內(nèi)的指標用綜合評定法進行篩選，多指標擬合采用Logistic回歸分析，用主成分分析法消除多重共線。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PLC組與BPD組12項腫瘤標志物的比較

除TSGF外，PLC組CEA、CA15-3、CA72-4、CA242、CYFRA 21-1、CA125、CA19-9、CA50、SCC-Ag、NSE和AFP水平均明顯高于BPD組（P＜0.01）。見表1。

表1 PLC組與BPD組12項腫瘤標志物水平的比較

2.2 各項腫瘤標志物的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，CA15-3、NSE、CA125、CEA、CYFRA 21-1、CA72-4的診斷價值為中等及以上（AUC≥0.7），TSGF、CA19-9、CA242、AFP、CA50、SCC-Ag的診斷價值一般（0.5≤AUC＜0.7）。在AUC≥0.7的腫瘤標志物中，NSE的敏感性最高，且Youden指數(shù)最高，是診斷能力最強的腫瘤標志物；CEA的特異性最高，且對疾病的判斷能力較強（+LR=6.67）。通過比較AUC可知，CA15-3、NSE、CA125、CEA和CYFRA 21-1的診斷能力相等（P＞0.05）；CA72-4、TSGF、CA19-9、CA242、AFP、CA50、SCCAg的AUC與CA15-3比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05、P＜0.01）。見表2。

2.3 多指標聯(lián)合模型的建立與驗證

2.3.1 提取公共因子 為提高診斷的準確性，在進行因子分析時僅選取AUC≥0.6的腫瘤標志物。此外，由于PLC組TSGF水平與BPD組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此進行因子分析時不納入TSGF。分別對PLC組和BPD組的原始數(shù)據(jù)進行標化，將PLC組11項指標標化后的數(shù)據(jù)代入變量。選擇KMO和Bartlett球度檢驗（設定特征值＞1，選擇四次方最大旋轉(zhuǎn)，選擇取消小系數(shù)并設值為0.5）。結(jié)果輸出為KMO=0.667、Bartlett球度檢驗P＜0.001、方差累積貢獻率為100%，滿足EFA分析條件。旋轉(zhuǎn)后成分矩陣和旋轉(zhuǎn)后3D載荷圖顯示PLC組11項指標被降維成4個公共因子，并按方差貢獻率大小順序排列。BPD組采用與PLC組同樣的方法進行因子分析。結(jié)果輸出為KMO=0.687、Bartlett球度檢驗P＜0.001、方差累積貢獻率為86%，滿足EFA分析條件。旋轉(zhuǎn)后成分矩陣和旋轉(zhuǎn)后3D載荷圖顯示BPD組11項指標被降維成3個公共因子，并按方差貢獻率大小順序進行排列。見表3、圖1。

PLC組中，CA242、CA50、CA125、CA19-9在公共因子1上具有較大的載荷系數(shù)，其中CA242、CA50和CA19-9為廣譜腫瘤標志物，CA125為PLC相關的腫瘤標志物[1]；CA72-4、CYFRA 21-1在公共因子2上具有較大的載荷系數(shù)，這2個腫瘤標志物均對非小細胞肺癌（nonsmall-cell lung carcinoma，NSCLC）有較高特異性[1-4]；SCC-Ag、NSE在公共因子3上具有較大的載荷系數(shù)，這2個指標分別對肺鱗癌（squamous cell lung carcinoma，SQLC）和小細胞肺癌（small-cell lung carcinoma，SCLC）有較高特異性[1-2，5-6]；CA15-3、CEA在公共因子4上具有較大的載荷系數(shù)，這2個指標對肺腺癌（adenocarcinoma，ADC）和大細胞肺癌（large cell carcinoma，LCC）的特異性較高[1-2]。AFP由于在各個公共因子中的載荷系數(shù)均較小，因此被剔除。將上述4個因子作為PLC的診斷指標，其中公共因子1診斷價值最高，可用于判斷陰陽性；公共因子2、公共因子3和公共因子4次之，在幫助診斷的同時，還有助于疾病的分型；肺癌診斷輔助因子可用于輔助疾病的鑒別診斷。BPD組被提取出3個公共因子，反映了各項腫瘤標志物指標在正常人群中的分布情況及相關性。

2.3.2 擬建聯(lián)合模型 經(jīng)文獻檢索可知，11種腫瘤標志物對肺癌均有診斷價值，但AFP、CA242、CA50和CA72-4的支持文獻較少[7-10]；而CA199、CA125、CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag、CA15-3、CEA的文獻證據(jù)充分，且CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag和CEA被列入歐洲腫瘤標志物學會（European Group on Tumor Markers，EGTM）[11]和美國臨床生化學會（the National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）[2]的指南中，推薦用于肺癌的診斷和分型。對公共因子1中的4種腫瘤標志物進行相關性分析，結(jié)果顯示CA242、CA50和CA19-9兩兩間呈強相關（P＜0.01）。CA19-9的診斷效能最優(yōu)，CA242的診斷效能與CA50差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此排除CA242和CA50，僅保留CA19-9。CA125與其他腫瘤標志物呈弱相關（P＜0.01），其診斷效能顯著高于其他腫瘤標志物（P＜0.01），見表4。對其他因子內(nèi)的指標采用同一方法進行篩選。在公共因子2中，CYFRA 21-1與CA72-4呈正相關（r=0.357，P＜0.01），兩者的診斷效能差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此排除CA72-4，保留CYFRA 21-1。在公共因子3中，NSE與SCC-Ag無相關性（r=0.019，P＞0.05），兩者的診斷效能差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），均予以保留。在公共因子4中，CA15-3與CEA呈正相關（r=0.501，P＜0.01），兩者的診斷效能差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，PLC組可由CA199、CA125、CYFRA 21-1、SCC、NSE、CEA、CA15-3組成聯(lián)合，標記為PLC預測模型。

表2 12項腫瘤標志物的診斷性能分析

表3 旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣

圖1 PLC組和BPD組旋轉(zhuǎn)后11項指標的3D載荷圖

2.3.3 聯(lián)合模型診斷價值 設因變量，PLC組標記為1，BPD組標記為0，采用Logistic回歸分析。先進行單因素分析，篩選出P＜0.1的變量，除AFP（P=0.355）外，其他10項指標均滿足條件。設因變量，PLC組標記為1，BPD組標記為0，采用Logistic回歸分析，10項腫瘤標志物強制進入?yún)f(xié)變量獲得預測概率（標記為Pre-P10），其AUC為0.849。PLC預測模型（PLC預測模型標記為1，與其對應的BPD組指標標記為0，兩者的集合標記為PLC-BPD）獲得預測概率（標記為Pre-P7）的AUC為0.831，與Pre-P10的AUC差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.744，P=0.081），因此兩者的診斷價值相等。

表4 4種腫瘤標志物的相關性分析和AUC比較

2.3.4 聯(lián)合模型最值臨界值 采用主成分分析法對PLC-BPD提取主成分，結(jié)果輸出為KMO=0.627、Bartlett球度檢驗P＜0.001、方差累積貢獻率為76%。獲得主成分方程并計算結(jié)果，利用二元Logistic回歸進行單因素分析，篩選出P＜0.1的變量。然后對滿足條件的主成分強制進入二元Logistic回歸擬合，PLC-BPD統(tǒng)計結(jié)果顯示-2LL=195.882，Cox & Snell R2=0.482，Nagelkerke R2=0.643，H-L檢驗=0.306，方程為Logistic（PLC）=-3.558+0.012×CEA+0.067×CA15-3+0.0 1 9×C Y F R A 2 1-1-0.0 0 3×C A 1 2 5+0.004×CA19-9+0.164×NSE-0.070×SCC-Ag。把Logistic（PLC）方程還原成原始變量方程并代入原始數(shù)據(jù)計算結(jié)果，用Medcalc v11軟件繪制ROC交互點圖，最佳臨界值為-0.958 8，可疑值范圍為-1.276～-0.732，見圖2。將余下的38例PLC患者和50例BPD患者的腫瘤標志物數(shù)據(jù)代入PLC-BPD模型，總符合率達82.9%，陽性符合率78.9%，陰性符合率86.0%。

3 討論

圖2 ROC交互點圖

肺癌患者的5年生存率主要取決于腫瘤分期，Ⅰ期患者的5年生存率達60%~70%，Ⅱ期為40%～50%，ⅢA期僅為15%～30%[2]，而患者在疾病的早期階段通常不會表現(xiàn)出特定的癥狀，因此PLC的早期確診對后續(xù)治療效果至關重要。目前，臨床主要采用腫瘤標志物對可疑病例進行篩查、評估預后，采用電子計算機斷層掃描或磁共振成像，結(jié)合組織檢查，輔以腫瘤標志物檢測診斷PLC。由于肺癌組織病理的多樣性和同種病理腫瘤細胞的異質(zhì)性，對PLC的早期診斷僅靠單項腫瘤標志物目前是無法實現(xiàn)的。多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測對不同類型PLC診斷的互補性可以有效彌補單項腫瘤標志物檢測的不足，但腫瘤標志物聯(lián)合項目越多，檢測結(jié)果的假陽性率越高。合理、有效、經(jīng)濟的使用腫瘤標志物組合既可對患者后續(xù)干預產(chǎn)生積極影響，也可避免不適宜檢測。在國內(nèi)現(xiàn)有的有關腫瘤標志物聯(lián)合檢測診斷PLC的文獻報道中，多數(shù)研究將重點放在腫瘤標志物聯(lián)合檢測的臨床價值上，但沒有說明如何獲取多種腫瘤標志物組合。本研究通過探索性研究，建立了診斷PLC的預測模型，并以此作為PLC的腫瘤標志物適宜檢驗策略。

本研究建立的PLC預測模型既包含了PLC的特異性腫瘤標志物（CYFRA 21-1、SCC-Ag、NSE、CEA），又納入了非特異性腫瘤標志物（CA19-9、CA125、CA15-3）。CYFRA 21-1是目前對NSCLC（SQCL）最敏感的腫瘤標志物，敏感性為23%～70%[12-13]，特異性約為90%[3]。NACB和EGTM均推薦CYFRA 21-1用于NSCLC的早期診斷和療效監(jiān)測[1-2]。ADC和LLC患者CEA水平顯著升高，與CYFRA 21-1結(jié)合可有效鑒別ADC和SQLC。有研究結(jié)果顯示，CEA不僅可用于PLC的診斷，還可作為化療效果的監(jiān)測指標[14]。SCC-Ag是SQLC的特異性腫瘤標志物，有文獻報道SCC-Ag的敏感性僅為15%～55%，不適合作為診斷指標[5]；但也有研究結(jié)果顯示，SCC-Ag結(jié)合CA125、NSE、CEA和CYFRA 21-1對NSCLC的診斷和分型有幫助[1，15]。SCLC患者的NSE陽性率顯著高于對照者，是SCLC高特異、高敏感的腫瘤標志物[1-2]。這些PLC特異性腫瘤標志物包含在公共因子2、3和4中，解釋了不同PLC亞型對PLC預測模型的貢獻率，同時聯(lián)合檢測這些PLC特異性腫瘤標志物也彌補了單項腫瘤標志物檢測效能不足的缺陷。CA125、CA19-9和CA15-3分別是卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌的特異性指標，不是PLC的優(yōu)勢型腫瘤標志物。但CA125由于與肺腺癌細胞識別的免疫分子OC125相同，因此是卵巢癌和肺癌細胞共同具有的抗原；而CA15-3也被證實存在于肺腺癌內(nèi)[16]。有研究結(jié)果顯示，CA125、CA15-3與PLC的病理分型密切相關，SQLC以CA125陽性率升高為主，ADC以血清CA15-3水平升高為主[17-18]。另有研究結(jié)果顯示，檢測NSCLS患者CA15-3、CA199、CA125水平可用于監(jiān)測癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況[19]。總之，對臨床高度懷疑為PLC的患者，CA125、CA199和CA15-3結(jié)合CYFRA 21-1、CEA檢測有一定的輔助診斷意義。因此，這些腫瘤標志物出現(xiàn)在PLC預測模型中也有其合理性。有研究結(jié)果顯示，3種腫瘤標志物聯(lián)合檢測早期診斷PLC的最優(yōu)組合為CEA、CYFRA 21-1、NSE[20-24]，4種腫瘤標志物聯(lián)合檢測的最優(yōu)組合為CEA、CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag[24-25]。采用Logistic回歸分析，使用PLC患者和BPD患者對這些腫瘤標志物的聯(lián)合檢測策略進行驗證。結(jié)果顯示，與其他聯(lián)合檢測策略比較，PLC預測模型的AUC和Youden指數(shù)均為最優(yōu)，在保持敏感性基本不變的前提下，提高了特異性，且真陽性檢出率大幅提高，見表5。進一步說明了本研究建立的PLC預測模型的合理性。

綜上所述，本研究采用統(tǒng)計分析與臨床實踐結(jié)合的方法，對PLC的診斷指標進行了優(yōu)化和組合，從臨床常用于PLC診斷的12種腫瘤標志物中遴選出7種腫瘤標志物組成聯(lián)合檢測模型。結(jié)果顯示，PLC預測模型與單項腫瘤標志物檢測相比，平衡了敏感性和特異性，檢測項目的減少并未降低診斷效能，而且還減輕了患者的經(jīng)濟負擔，減少了不適宜檢驗，具備一定的臨床應用價值。但是，該模型是否能在臨床上推廣應用仍有待驗證。因為在制定臨床檢驗策略時，還應根據(jù)患者的實際病情推薦更細化的方案，如基于不同病種、不同病情提出更精準、更有針對性的臨床適宜檢驗方案，這也是我們下一步研究的方向。

表5 PLC預測模型與不同腫瘤標志物聯(lián)合檢測策略比較