土壤熏蒸處理對連作三七生長發(fā)育及土壤理化性狀的影響△

歐小宏，劉迪秋，王麟猛，楊野*，崔秀明*

(1.昆明理工大學，生命科學技術學院，云南 昆明 650500；2.云南省三七資源可持續(xù)發(fā)展利用重點實驗室，云南 昆明 650500；3.國家中藥管理局三七資源可持續(xù)發(fā)展利用研究室，云南 昆明 650500；4.云南省文山七麒三七科技有限公司，云南 文山 663000)

三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen為五加科人參屬植物，具有活血化瘀、消腫定痛等功效，是我國特有的名貴中藥材。云南是三七的道地主產區(qū)，占總種植面積的98%以上，僅2016年的農業(yè)產值就高達100億元，已成為云南省重要的經濟支柱之一。三七是宿根植物，忌地性極強，三年七收獲后的土地如再次種植(重茬)三七，發(fā)病率可達90%以上[1]。三七需要間隔(輪作或休閑)8～10年以上才能再次種植[2]。為此，三七種植不得不向非道地產區(qū)的貴州、四川等地擴散[3]，嚴重影響了三七的道地性。

當前，廣大學者對三七連作障礙產生機制已有比較全面的認識，其產生原因主要有：(1)土壤微生物群落的改變，病原微生物增加，有益微生物減少，土傳病蟲害加??；(2)化感物質引起的自毒作用；(3)土壤鹽漬化和酸漬化加重及土壤養(yǎng)分等理化性狀改變。根據其產生原因，對連作土壤進行滅菌是防治三七連作障礙的方式之一。如可采用有機硫熏蒸劑[4]、火燒[5]、臭氧熏蒸[6]等方式對連作土壤進行滅菌。清除三七連作土壤化感物質也是防治三七連作障礙的方式之一。如利用小麥與三七輪作可以消除連作土壤中的酚酸類物質[7]。此外，改善土壤理化性狀也是防治三七連作障礙的方式之一。如通過合理的氮磷肥施用量[8]，以及添加土壤改良劑[9]、過氧化鈣[10]等方式也可緩解三七種植土壤的連做障礙。

目前，土壤熏蒸消毒是防治蔬菜等作物連作障礙最有效的手段[11]。溴甲烷是應用最廣且效果最優(yōu)良的防治連作障礙的土壤熏蒸劑，能有效的防除土壤中的病原真菌、細菌、線蟲、地下害蟲及雜草等[12-13]。然而，由于溴甲烷對大氣臭氧層的破壞性，從1997年開始逐漸被禁止使用，我國已于2015年全面禁止溴甲烷的使用[14]。當前已出現了各種溴甲烷的替代品，氯化苦就是較好的替代品之一。研究表明，氯化苦熏蒸處理能夠殺死土壤85%以上的細菌、真菌和放線菌[15]，還對雜草具有一定的防治效果[16]。2015年農業(yè)部14號公告規(guī)定[17]：禁止殺撲磷、甲拌磷、甲基異柳磷、克百威、氯化苦、溴甲烷使用于蔬菜、瓜果、茶葉、甘蔗、中草藥材等作物，將溴甲烷、氯化苦農藥登記的使用范圍變更為土壤熏蒸。雖然氯化苦不能直接用于作物殺菌，但用于土壤熏蒸是安全可靠的，氯化苦在土壤中的半衰期只有0.2～4.5 d[18]，連續(xù)使用對土壤及農作物無殘留，也無不良的影響，對地下水無污染[19]。我國山東地區(qū)已廣泛采用氯化苦熏蒸土壤防治姜瘟[20]。因此，利用氯化苦熏蒸土壤防治連作障礙具有十分廣闊的應用前景，但其在三七連作障礙防治中的應用鮮見報道。

因此，本研究采用田間小區(qū)試驗研究了氯化苦熏蒸處理三七連作土壤，探索了該處理對連作土壤理化性質、三七生長及品質、氯化苦殘留量等的影響，以期為氯化苦在三七連作障礙防治中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2015—2016年在云南省文山州文山市平壩鎮(zhèn)進行，E：104°8′6.918″，N：23°15′18.458″。試驗區(qū)屬中亞熱帶季風氣候，海拔1756 m，年均日照時數2028 h，年均積溫6 829.3℃，年平均氣溫18.4℃，年均晝夜溫差11.7℃，平均相對濕度75%，年均降雨量1 187.8 mm，無霜期323～329 d。供試土壤為紅壤，是種植2年(一輪)三七的連作土壤，中間無間隔或輪作，基本理化性狀為：pH 6.50，有機質8.42 g·kg-1，全氮 0.81 g·kg-1，堿解氮 88.72 mg·kg-1，全磷 0.94 g·kg-1，有效磷 60.47 mg·kg-1，全鉀 11.22 g·kg-1，速效鉀 170.57 mg·kg-1。

1.2 供試材料

一年生三七幼苗購于文山三七市場，復合肥(N-P2O5-K2O=15∶15∶15，云南云天化國際化工股份有限公司)，氯化苦(CCl3NO2，大連綠峰化學股份有限公司)。

1.3 試驗設計

試驗采用田間小區(qū)實驗，小區(qū)規(guī)格為2 m×15 m，設無熏蒸和熏蒸兩個處理，重復3次。無熏蒸處理為對照，即土壤不做任何處理；熏蒸處理為先用氯化苦熏蒸處理土壤，具體操作：將地深翻平整后，氯化苦用量為50 g·m-2，利用專用注射器注射到土壤墑面15 cm土層后，立即覆蓋薄膜對土壤進行熏蒸消毒處理，20 d后揭去薄膜，再自然晾曬15 d，備用。所有三七種植農事操作均按照常規(guī)管理進行。2015年1月10日按照株行距15 cm×20 cm移栽一年生三七，分別于2015年和2016年3月和7月追施復合肥2次，追肥量分別為每畝100和120 kg(1畝≈666.7 m2)。三七出苗整齊后，對各處理每月存苗率進行調查統(tǒng)計，于2015年7月(二年生)和2016年12月(三年生)對三七和土壤進行取樣，測定三七農藝性狀、土壤理化性狀、氯化苦殘留量及藥效成分成分含量。

1.4 測定項目

1.4.1 存苗率及農藝性狀 三七出苗整齊后對各處理存苗數進行調查統(tǒng)計，由于無熏蒸處理三七于2015年8月左右已無存苗，故未對其2016年三七存苗率和農藝性狀進行統(tǒng)計。

(1)

2015年7月(二年生)和2016年12月(三年生)取樣測定三七株高、葉片長寬、剪口長寬、塊根長寬、須根長、生物量等農藝性狀后，自然風干，粉碎，備用。

1.4.2 土壤理化性狀 2015年7月和2016年12月分別取無熏蒸和熏蒸處理土壤樣品，并測定其理化性狀。參考《土壤分析技術規(guī)范(第二版)》[21]，pH采用電位法，交換性酸采用KCl交換-中和滴定法，石灰需要量采用氯化鈣-中和滴定法，陽離子交換量采用乙酸銨交換法，有機質采用重鉻酸鉀-容量法，全氮采用凱氏定氮法，堿解氮采用堿解擴散法，全磷采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法，有效磷采用Olsen法，全鉀采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法，速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法。

1.4.3 土壤微生物數量 2015年7月和2016年12月分別取無熏蒸和熏蒸處理土壤樣品，保存于4 ℃冰箱，用于細菌、真菌和放線菌數量測定。參考劉星等[22]采用稀釋平板法，真菌采用馬丁培養(yǎng)基，細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基。

1.4.4 氯化苦含量測定

樣品提?。?0 g土壤或植株樣品于具塞三角瓶加50 mL石油醚，冰箱中浸泡過夜，超聲提取10 min，靜置1小時，取上清液用氣相色譜測定。

儀器：Agilent 7890A氣相色譜儀配備Agilent 7694E頂空自動進樣器和電子捕獲檢測器，安捷倫公司毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

色譜條件：進樣口溫度150 ℃，柱溫60 ℃，保持6 min，檢測器溫度250 ℃，載氣為高純氮氣，載氣流量20 mL·min-1，分流比30∶1，柱流量1 mL·min-1，尾吹30 mL·min-1。頂空進樣器條件：爐箱溫度80 ℃，樣品環(huán)溫度85 ℃，傳輸線溫度90 ℃，瓶加熱時間3 min，瓶加壓時間0.1 min，樣品環(huán)填充時間0.5 min，樣品環(huán)壓力穩(wěn)定時間0.05 min，進樣時間0.5 min，循環(huán)時間6 min[19]。

1.4.5 三七素和皂苷含量測定

三七素提?。喝?.5 g三七粉末樣品，加入10 mL超純水，超聲提取15 min，3000 r·min-1離心，重復提取2次，合并上清液，定容至25 mL，供HPLC用。

HPLC條件：X-Amide色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.2%磷酸(A)-乙腈(B)，洗脫條件：0 min 70% B，10 min 76% B，15 min 80% B， 流速為1.0 mL·min-1， 檢測波長213 nm，柱溫24oC，進樣量10 μL[23]。

三七皂苷含量測定皂苷提?。喝?.3 g三七樣品，加25 mL 70% 甲醇浸提過夜，超聲40 min，3000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜，備用。

HPLC條件：色譜柱為Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為水(A)-乙腈(B)進行線性洗脫(V/V)，洗脫條件為0 min 20% B，20 min 40% B，40 min 50% B，50 min 100% B；流速為1 mL·min-1；柱溫為 30 ℃；檢測波長為203 nm[24]。

1.4.6 數據分析 采用SPSS 18.0對實驗數據進行獨立樣本T檢驗。

2 結果與分析

2.1 氯化苦熏蒸處理對連作三七存苗率及農藝性狀的影響

無熏蒸處理的出苗率，即2015年3月存苗率(65%)比熏蒸處理(88%)低21%；無論熏蒸與否，三七存苗率均顯著降低，但無熏蒸處理出苗5個月后(8月)已全部死亡，熏蒸處理三七存苗率移栽一年后為68%，移栽2年后仍有60%，在移栽第二年內基本無死亡。說明氯化苦熏蒸處理連作土壤能夠降低三七死亡率，提高出苗率和存苗率。

注：由于無熏蒸處理于2015年8月存苗率已為0，故無熏蒸處理沒有統(tǒng)計2016年存苗率。圖1 氯化苦熏蒸處理對連作三七存苗率的影響±SD，n=3)

無熏蒸處理三七根系發(fā)育差，須根少且短，而熏蒸處理根系發(fā)育良好，須根多且長(圖2)。表1也表明，熏蒸處理三七的株高，葉片長、葉柄長、須根長、剪口長和寬，主根長和寬，主根生物量等指標均顯著或極顯著大于未熏蒸處理，其中主根鮮重增加了84%，主根干重增加了111%。說明氯化苦熏蒸處理可以促進連作三七生長，尤其是根系生長。

注：圖中三七為二年生，取于2015年7月。圖2 氯化苦熏蒸處理對連作三七生長狀況的影響

表1 氯化苦熏蒸處理對連作三七農藝性狀的影響

注：無熏蒸處理于2015年8月存苗率已為0，故2016年無熏蒸處理無三七樣品;*和**表示無熏蒸和熏蒸處理2015年三七農藝性狀分別在P<0.05和0.01水平差異具統(tǒng)計學意義。

2.2 氯化苦熏蒸對連作三七土壤理化性狀變化的影響

與無熏蒸處理相比，熏蒸處理連作三七土壤1年后(2015年)，土壤pH、陽離子交換量、全磷和全鉀含量均無顯著變化；交換性酸、石灰需要量、全氮、堿解氮、有效磷含量顯著降低，降幅分別為56%、15%、15%、17%和47%；而有機質和速效鉀含量顯著增加，增幅分別為16%和65%(表2)。與無熏蒸處理相比，熏蒸處理連作三七土壤2年后(2016年)，土壤pH、石灰需要量、全氮、堿解氮和全鉀含量均無顯著變化；交換性酸、全磷和有效磷含量顯著降低，降幅分別為39%、31%和52%；而陽離子交換量、有機質和速效鉀含量均顯著增加，增幅分別為13%、15%和56%(表2)。說明氯化苦熏蒸連作三七土壤可降低其交換性酸、石灰需要量，增加土壤有機質和速效鉀含量，但會降低土壤氮、磷含量。

表2 氯化苦熏蒸對連作三七土壤理化性質的影響

注：***，**和*分別表示無熏蒸和熏蒸處理間在P<0.001，P<0.01和P<0.05水平差異具有統(tǒng)計學意義。

2.3 氯化苦熏蒸對連作三七土壤微生物數量變化的影響

與無熏蒸處理相比，氯化苦熏蒸處理使土壤細菌、真菌和放線菌數量均顯著降低，其中細菌數量2015年和2016年分別降低了50%和37%；真菌數量2015年和2016年分別降低了19%和28%；放線菌數量2015年和2016年分別降低了38%和38%(圖3)。說明氯化苦熏蒸可以使連作三七土壤細菌、真菌和放線菌數量減少。

注：***，**和*分別表示無熏蒸和熏蒸處理間在P<0.001，P<0.01和P<0.05水平上達到顯著差異。圖3 氯化苦熏蒸處理對連作三七土壤微生物數量的影響

2.4 氯化苦熏蒸處理對氯化苦殘留的影響

無論熏蒸與否，在土壤和植株中均未檢測到氯化苦(表3，圖4)，說明氯化苦熏蒸連作三七土壤不會造成氯化苦在土壤和植株中的殘留。

表3 氯化苦熏蒸處理對連作三七土壤及植株氯化苦殘留量的影響

注：N.D.表示未檢出。

2.5 氯化苦熏蒸處理對連作三七地下部分有效藥用成分含量的影響

表4表明，與無熏蒸處理相比，氯化苦熏蒸處理對連作三七地下部分三七素、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1含量均無顯著影響，但顯著降低了人參皂苷Re含量，顯著增加了人參皂苷Rd含量，但對這5種皂苷的總和無顯著影響。說明氯化苦熏蒸連作三七土壤不會影響三七有效藥用成分含量。

注：a.氯化苦標準品；b.土壤樣品；c.三七植株樣品。圖4 氯化苦氣相色譜圖

表4 氯化苦熏蒸對連作三七藥用成分含量的影響

注：由于無熏蒸處理于2016年已無存活，故二年生三七取于2015年7月，熏蒸處理三年生樣品取于2016年12月；*表示無熏蒸和熏蒸處理之間二年生三七藥用成分含量在P<0.05水平差異具統(tǒng)計學意義。

3 討論

3.1 氯化苦熏蒸對連作三七存苗率及土壤理化性狀影響

連作三七發(fā)病率在90%以上[1]，主要是因為種植三七會使土壤微生物組成發(fā)生變化[2，25-26]、土壤養(yǎng)分失衡[27-28]等。張子龍等研究發(fā)現連作三七土輪作7年后三七存苗率可以達到60%，土壤中細菌數量降低，放線菌數量增加[2]。歐小宏等也發(fā)現通過“調酸，減氮，保磷，增鉀，補充微量元素”的施肥方式，以及添加甘蔗渣作為土壤改良劑，可以提高連作三七的存苗率達31.6%[9]。本研究表明，氯化苦熏蒸處理連作三七土壤后，三七移栽一年后的存苗率達到68%，移栽2年后存苗率達到60%(圖1)。該結果與連作三七土輪作7年后的存苗率(60%)相似[2]，說明氯化苦熏蒸連作三七土壤可以縮短連作三七土壤的輪作時間。一方面是因為氯化苦對土壤微生物的殺滅率在85%以上[15]，在短期內微生物會呈現“抑制-恢復”的趨勢[29]，從而使有益與有害微生物的數量趨于平衡。本研究結果表明，氯化苦熏蒸處理使連作三七土壤細菌、真菌和放線菌數量顯著降低(圖3)，與尋路路[30]發(fā)現三七健康株根際土細菌數量顯著低于病株根際土，而真菌數量顯著高于病株根際土的結果相似。另一方面是因為氯化苦熏蒸能夠殺死土壤中微生物，打破了土壤礦質元素的礦化與微生物固持之間的平衡，使其礦化作用大于固持作用，從而可以提高土壤中礦質元素含量[31-32]，有利于連作三七土壤養(yǎng)分平衡。本研究結果發(fā)現氯化苦熏蒸處理使連作三七土壤中氮、磷含量顯著降低(表2)，該結果與張子龍等[2]研究發(fā)現連作三七土壤輪作7年后土壤氮、磷含量降低相似，但與馬濤濤等[31]和顏冬冬等[32]發(fā)現氯化苦熏蒸使土壤氮含量升高相反。主要原因可能是熏蒸處理連作土壤后再種植三七，土壤中的氮磷鉀被三七植株吸收帶走；不熏蒸處理直接種植，三七在移栽后8個月內全部死亡，土壤中氮磷養(yǎng)分大部分仍保留在土壤中，從而增加了養(yǎng)分的微生物固持量。此外，本研究還表明氯化苦熏蒸處理降低了連作三七土壤交換性酸、石灰需要量(表2)，這也是導致連作三七存苗率較高的原因。因為三七種植使土壤酸化是導致連作障礙的原因之一，通過添加石灰調節(jié)土壤酸性可以使三七的存苗率增加[9]。

3.2 氯化苦熏蒸對連作三七產量及品質影響

3.3 土壤及三七藥材氯化苦殘留

本研究表明氯化苦熏蒸處理連作三七土壤，不會導致氯化苦在三七植株中殘留(表3，圖4)，結果與氯化苦熏蒸土壤后種植黃瓜和番茄，其果實中也不會有氯化苦殘留的結果一致[36]；也不會導致氯化苦在土壤中殘留(表3，圖4)，因為氯化苦的半衰期僅0.2～4.5 d，11天后在土壤中基本檢測不到氯化苦殘留[37]。雖然氯化苦對土壤進行熏蒸消毒具有操作簡單、不會對土壤和作物造成殘留等優(yōu)點，但也需要注意氯化苦具有極高的蒸汽壓，對人體眼睛、黏膜、肺以及皮膚具有強烈的刺激性[38]。所以為防止因氯化苦散發(fā)而降低熏蒸效果，以及對人體的危害，利用氯化苦對連作三七土壤進行熏蒸消毒時，應將氯化苦施入土層并立即覆蓋薄膜防止其揮發(fā)；操作人員要嚴格按照操作規(guī)范進行土壤消毒作業(yè)。此外，加強機械作業(yè)、研發(fā)新劑型等也將是氯化苦在三七連作障礙防治中需要加強的研究方向。綜上，氯化苦在三七連作障礙防治方面具有廣闊的應用前景。

4 結論

氯化苦熏蒸連作三七種植土壤，可以顯著增加種植三七的存苗率，促進三七生長，而且不會對三七造成氯化苦殘留，也不會影響三七有效藥用成分的含量。因此，氯化苦對于三七連作障礙的防治具有良好的效果，建議在生產中根據實際情況調整使用。