三七不同部位化學(xué)成分的差異性研究△

沙孟晨，周永峰，張海珠*，李楊，秦琴

(1.大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；2.解放軍第302醫(yī)院 全軍中藥研究所，北京 100039 )

三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥根及根莖[1]。主產(chǎn)于我國云南，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材。三七歷來享有“人參之王”的美譽，三七中的總皂苷為三七的主要藥理活性成分，其含量約為12%[2]，具有散瘀止血，消腫定痛的功能?，F(xiàn)代研究表明，三七具有活血止血[3-4]，抗腫瘤[5-6]以及調(diào)節(jié)免疫[7]等多種功效。另外，在三七在治療心血管疾病方面也具有獨特療效[8]。近年來，隨著研究者的深入研究，三七藥用價值得到廣泛的開發(fā)，需求量逐漸增加。三七的道地產(chǎn)區(qū)目前公認為文山州[9]，但是目前文山州適宜種植三七的土地資源已經(jīng)非常緊缺，主要原因是土地的連作障礙，因此嚴(yán)重影響了三七的市場供應(yīng)量。

《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定三七為其原植物的根和根莖，其中三七主根為臨床主要用藥部位[1]。三七主根主要由表皮、皮層以及木質(zhì)部三部分組成，此外，三七還包括側(cè)根，絨根，剪口等部分。三七總皂苷提取物生產(chǎn)廠家常用三七剪口或側(cè)根為原料，民間也有使用三七葉和三七花[10]。為對三七的藥用價值進一步充分開發(fā)挖掘，充分合理的利用三七的不同部位，本實驗在總結(jié)比較前人實驗研究后，比較系統(tǒng)的對三七藥材中不同部位的化學(xué)成分差異進行了研究，以期為三七藥材不同部位的合理應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

三七藥材分別采于云南省文山市，玉溪市以及昆明市等種植基地，為同一批次3年生樣本，共計15份，如表1所示。所有藥材均經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院夏從龍教授鑒定為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根莖，將其分為表皮、皮層、木質(zhì)部、側(cè)根、絨根及剪口等部分。

表1 三七樣品采集信息表

1.2 儀器與試劑

安捷倫1120HPLC，KQ-500DE型超聲清洗器(工作頻率：50 Hz超聲電功率：250 W)，AB135-S型電子分析天平，DFT-50型手提式高速萬能粉碎機。實驗用水為哇哈哈純凈水，除甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

對照品三七皂苷R1(批號：110745-200617)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201027)、人參皂苷Rb1(批號：110704-201122)、人參皂苷Rd(批號：111818-201001)、人參皂苷Re(批號：110754-200822)均從成都普瑞法科技開發(fā)有限公司購買，純度均≥98%。

1.3 化學(xué)含量測定

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters Acquity HSS T3 柱(2.1×100 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈(A)和水(B)的混合物，梯度洗脫程序為：0.00～5.00 min：15%～17% A；5.01～10.00 min：17%～21% A；10.01～15.00 min：21%～60% A；檢測波長210 nm，進樣量為2.0 μL，流速0.30 mL·min-1，柱溫30 ℃，柱平衡時間為2分鐘。

1.3.2 對照品溶液的制備 分別稱取三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd對照品適量，以分析天平精密稱量，經(jīng)過色譜級甲醇超聲溶解后[11]，置于10 mL 容量瓶中，補足過程中失去的重量后定容至刻度線，然后用微孔濾膜 (0.22 μm)濾過，依次得到濃度為0.108 4、0.164 3、0.193 2、0.190 1、0.167 3 mg·mL-1的對照品溶液，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備 將表皮、皮層、木質(zhì)部、側(cè)根、絨根以及剪口等三七各部分樣品粉碎，分別精密稱取各樣品粉末 0.30 g，置于具塞三角瓶中加甲醇 25 mL，密塞后稱定重量，搖勻，放置過夜，超聲(250 W，50 Hz)提取30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補足失量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，提取液用微孔濾膜 (0.22 μm)濾過，即得供試品溶液[12]。

1.3.4 精密度考察 精密吸取“1.3.2”項下中間濃度的混合對照品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣 6 次，記錄峰面積，計算 RSD。

1.3.5 重復(fù)性考察 精密稱取同一樣品 6份，按“1.3.3”項下方法平行制備三七供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進樣，計算各皂苷類成分的含量。

1.3.6 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件分別于制備后的0、3、6、12、24 h進樣測定，以峰面積計算 RSD。

1.3.7 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.3.2”項下的混合對照品儲備液，依據(jù)“1.3.1”項下色譜條件，分別進樣0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 μL，記錄各色譜峰峰面積，進行線性回歸，縱坐標(biāo)為峰面積，橫坐標(biāo)為進樣量(μg)，得到回歸方程。結(jié)果(表 2)表明各成分線性關(guān)系良好。

1.3.8 加樣回收率實驗 取同一批號且含量已知的三七樣品粉末0.1 g共6份，精密稱量，并分別精密加入與樣品中等量的三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd對照品溶液，按照“1.3.3”項下方法制成供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進行測定。計算各皂苷類成分的含量和加樣回收率。

1.3.9 樣品含量測定 分別取三七的表皮、皮層、木質(zhì)部、側(cè)根、絨根以及剪口的各部分樣品，用“1.3.3”項下方法制成供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進行測定，并記錄峰面積，用外標(biāo)法計算樣品中5種皂苷類成分的含量，結(jié)果見表 2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

偏最小二乘判別分析(PLS-DA)：對不同批次三七藥材不同部位中的5種皂苷類化學(xué)成分的含量進行綜合分析，分析軟件為SIMCA-P+11.0版軟件，以考察三七藥材不同部位的總體差異，統(tǒng)計學(xué)參數(shù)為軟件默認的參數(shù)。

聚類分析：采于Metaboanalyst(http：//www.metaboanalyst.ca/)在線分析對三七藥材不同部位的化學(xué)成分進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

采用“1.3.1”項下條件，典型色譜圖如圖1所示。方法學(xué)考察結(jié)果(見表2)表明本實驗所采用方法能夠有效分離5種皂苷類成分，分離效果好，溶液制備方法簡單，實驗操作簡便，重復(fù)性好，因此可用于測定三七藥材5種皂苷類成分的含量。

用超高效液相色譜法測定五種化合物的并對其進行方法學(xué)考察。表2數(shù)據(jù)表明化合物在線性范圍內(nèi)的濃度和峰面積具有較好的關(guān)系(r≥0.999 9)。五種化合物的重現(xiàn)性相對偏差較小，(RSD≤0.31%)，穩(wěn)定性好(RSD≤0.32%)，儀器精密度較高(RSD≤0.68%)，加樣回收率較高，化合物分析損失程度低(RSD≥97.6%)。這些結(jié)果表明，該方法靈敏度高，線性擬合度較好。

注：A.對照品色譜圖；B.三七樣品色譜圖；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Re；4.人參皂苷Rb1；5.人參皂苷Rd圖1 三七UPLC色譜圖

2.2 含量測定

不同皂苷類化學(xué)成分在三七不同部位的主要分布情況見圖2。

實驗結(jié)果表明5種皂苷類化學(xué)成分在三七不同部位的上分布具有一定的差異性，其中剪口含量較高而絨根則含量較低。對于臨床常用的三七主根而言，其表皮，皮層以及木質(zhì)層中皂苷的含量均較高。

表2 方法學(xué)考察結(jié)果

注：A.三七皂苷R1的含量；B.人參皂苷Rg1的含量；C.人參皂苷Re的含量；D.人參皂苷Rb1的含量；E.人參皂苷Rd的含量；F.5種皂苷的總含量。圖2 三七不同部位化學(xué)成分的含量

2.3 不同部位與化學(xué)成分含量的相關(guān)性分析

以5種不同的化學(xué)成分為參數(shù)對三七藥材的不同部位進行聚類分析，結(jié)果表明三七藥材的不同部位其物質(zhì)基礎(chǔ)同樣存在顯著的差異性，從聚類結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)三七藥材中的不同部位根據(jù)其化學(xué)成分的差異大致可分為三大類，其中側(cè)根和皮層的化學(xué)成分含量相近可大致劃分為一類，絨根因其所有化學(xué)成分含量均較低而單獨分為一類，三七藥材中的剪口、表皮以及木質(zhì)部劃分為一類。

注：1.剪口；2.側(cè)根；3.絨根；4.表皮；5.皮層；6.木質(zhì)部。圖3 三七藥材不同部位與化學(xué)成分含量的聚類熱圖

以5種不同的化學(xué)成分為參數(shù)對三七樣品的不同部位進行PLS-DA分析，實驗結(jié)果表明三七樣品的不同部位在一定程度能夠區(qū)分，其中說明其物質(zhì)基礎(chǔ)是具有顯著差異性的，其中絨根、剪口、表皮以及木質(zhì)部均具有一定的區(qū)分度，而側(cè)根和皮層則由于其化學(xué)成分的關(guān)系區(qū)分度較低。其Loading Plot 分析結(jié)果表明在區(qū)分三七樣品的不同部位時，5種皂苷類化學(xué)成分均具有較強的貢獻程度，其中Rg1，Rb1和Rd作為主要的化學(xué)成分物質(zhì)可用于區(qū)分三七樣品不同部位。

注：1.剪口；2.側(cè)根；3.絨根；4.表皮；5.皮層；6.木質(zhì)部。圖4 三七藥材不同部位與化學(xué)成分含量的得分散點圖

圖5 三七藥材不同部位與化學(xué)成分含量的載荷散點圖

3 討論

本實驗通過UPLC法同時測定三七藥材不同部位中5種皂苷類成分的含量，并進行方法學(xué)考察，實驗結(jié)果表明UPLC法靈敏度高，準(zhǔn)確性好。為了進一步對三七不同部位中5種皂苷類成分進行差異性分析，采用聚類分析，OPLS-DA分析等方法進行了初步的分析，實驗結(jié)果表明三七藥材中不同部位的化學(xué)成分含量的差異性較為顯著，其中剪口部位5種皂苷類成分的含量最高，而絨根部位的化學(xué)成分含量則明顯較低。

三七不同部位的含量測定結(jié)果表明三七藥材剪口中5種皂苷類成分的含量均高于其他部位，并且三七藥材中剪口，側(cè)根以及絨根中5種皂苷類成分的化學(xué)含量均呈現(xiàn)出降低的趨勢。三七主根的不同部位除人參皂苷Re的含量分布于表皮較多之外，其余四種化學(xué)成分的含量均沒有顯著性差異。實驗結(jié)果提示三七不同部位因其化學(xué)成分的差異可用于不同的用途，如三七剪口和主根等部位因皂苷類化學(xué)成分含量較高，可作為三七的主要藥用部位服務(wù)于臨床，而絨根部位則化學(xué)成分含量較低，可用于相關(guān)醫(yī)藥企業(yè)有效成分提取的主要部位。

王國俊等[13]發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1能夠抑制白血病HL-60細胞的增殖并促使其凋亡，本實驗結(jié)果顯示三七剪口和木質(zhì)部中三七皂苷R1的含量較高，對于該疾病的治療，臨床上可以選用三七剪口和木質(zhì)部部位入藥。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，三七皂苷Rb1通過雌激素受體調(diào)節(jié)色素上皮衍生因子PEDF來抑制內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)形成。本實驗結(jié)果可指導(dǎo)該疾病治療上三七入藥部位，其中剪口、木質(zhì)部、皮層的含量相對較高，提高三七藥材的合理使用率。

綜上所述，本實驗為三七不同部位的合理應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。有效的提高三七藥材的利用率。