乳腺癌淋巴微轉(zhuǎn)移模型的建立及皮內(nèi)與靜脈注射18F-脫氧葡萄糖的診斷效果

李永霞，鄭營營，孫玉云，何思敏,4，羅建民，張建平,4，曹天野,4，王明偉,4，章英劍,4

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，上海200032；

3.上海市質(zhì)子重離子醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海201315；

4.上海分子影像探針工程技術(shù)研究中心，上海200032

［關(guān)鍵字］ 乳腺癌；淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；皮內(nèi)注射；靜脈注射；18F-脫氧葡萄糖PET/CT成像

靜脈注射18F-脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG）后的代謝顯像已廣泛用于惡性腫瘤分期和療效評價［1］，包括用于乳腺癌腋窩淋巴結(jié)和內(nèi)乳淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷［2-4］。近年來有研究者采用手持型高能γ探測器，用于18F-FDG靜脈注射后術(shù)中指導(dǎo)乳腺癌病灶清除［5］，還有研究者采用局部皮內(nèi)注射18F-FDG進行小鼠前哨淋巴結(jié)顯像［6］，提出“正電子淋巴結(jié)顯像”（positron lymphography）的概念。本研究構(gòu)建乳腺癌淋巴微轉(zhuǎn)移小鼠模型，比較區(qū)域性皮內(nèi)與靜脈注射18F-FDG后小鼠PET/CT成像，以評估不同注射方式下18F-FDG PET/CT對乳腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移成像的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物

4T1乳腺癌腫瘤細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫。SPF級8周齡BALB/c雌性裸鼠6只，體質(zhì)量20～25 g，購于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物部，顯像前2周于實驗中心飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑和儀器

18F-FDG和99mTc-SC由本科室自制。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。小動物PET/CT（型號Inveon，購自德國Siemens公司）、小動物SPECT/CT（型號Bioscan，匈牙利Mediso公司）均為本科室擁有。

1.1.3 細胞培養(yǎng)及腫瘤淋巴微轉(zhuǎn)移動物模型的建立

細胞培養(yǎng)主要參考美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）提供的方法。4T1細胞用DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3～4 d在細胞對數(shù)生長期時按1∶3傳代培養(yǎng)。以無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌，調(diào)整活細胞密度為1×106個/mL，制成細胞懸濁液，分別在6只雌性裸鼠右側(cè)第二乳房脂肪墊內(nèi)注射0.1 mL。成瘤3 d后，手術(shù)取出部分瘤，術(shù)后第11天成像。有創(chuàng)傷操作均在潔凈麻醉下進行。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房。

1.2 研究方法

1.2.1 荷瘤小鼠淋巴結(jié)PET/CT和SPECT/CT顯像

嚴格遵守《實驗動物科學(xué)與管理》，所有操作過程均于麻醉（1%～2%異氟烷與空氣混合物）狀態(tài)下進行。每次18F-FDG成像前禁食4 h，先在左、右前爪皮內(nèi)分別等量注射3.7 MBq18F-FDG，總劑量為7.4 MBq，1 h后小動物PET/CT顯像；24 h后尾靜脈注射7.4 MBq18F-FDG，再次顯像。PET/CT顯像按三維模式采集10 min靜態(tài)圖像，并采用OSEM3D/MAP法重建，獲得衰減校正后的PET/CT融合圖像。然后在疑似有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的荷瘤鼠左、右兩側(cè)前爪皮內(nèi)分別注射3.7 MBq锝硫膠體（technetium sulfur colloid，99mTc-SC），1 h后進行SPECT/CT靜態(tài)顯像，并測量瘤周淋巴結(jié)和對側(cè)淋巴結(jié)放射性占注入量的百分比（%ID/g）。

顯像后處死裸鼠，摘取腫瘤組織、瘤周淋巴結(jié)和對側(cè)淋巴結(jié)標(biāo)本，用10%中性甲醛溶液固定。

1.2.2 病理學(xué)分析

荷瘤裸鼠腫瘤組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，切片厚5 μm，行H-E染色。用SAB法分別檢測腫瘤組織、瘤周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、對側(cè)陰性淋巴結(jié)中上皮細胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（Glut-1）的水平。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Image-Pro Plus 6.0分析陽性細胞率，SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示，單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 18F-FDG不同注射方式下荷瘤小鼠PET/CT成像差異

前爪皮內(nèi)注射18F-FDG后，有2只小鼠瘤周腋下淋巴結(jié)攝取值異常增高，ID%/g值為19.2±2.0，明顯高于對側(cè)淋巴結(jié)（ID%/g為6.8±0.4）及其他4只小鼠相同位置淋巴結(jié)（ID%/g為7.2±0.4）（P＜0.001；圖1A）。靜脈注射時，所有小鼠瘤周腋下淋巴結(jié)幾乎與背景相當(dāng)（圖1B），ID%/g值為2.5±0.5。

此外，瘤周淋巴結(jié)攝取較高的荷瘤小鼠前爪皮內(nèi)注射傳統(tǒng)淋巴結(jié)顯像劑99mTc-SC后1 h，可觀測到細長淋巴引流區(qū)域，兩側(cè)出現(xiàn)4個放射性攝取增高淋巴結(jié)，ID%/g值約為0.32±0.3，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.415）。瘤周側(cè)的一個淋巴結(jié)與18F-FDG高攝取淋巴結(jié)位置相吻合。

2.2 4T1乳腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的免疫組織化學(xué)結(jié)果

圖1 不同注射方式下的PET和SPECT成像圖及攝取值A(chǔ)：同一只荷瘤小鼠，前爪皮內(nèi)注射；B：尾部靜脈注射18F-FDG后1 h的腫瘤PET/CT成像剖面圖（n=3）；C：前爪皮內(nèi)注射淋巴顯像劑99mTc-SC后1 h SPECT/CT成像的腫瘤最大密度投影圖和剖面圖（n=3）

解剖后發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)注射18F-FDG攝取較高的小鼠（2/6）瘤周淋巴結(jié)為紅色稍大淋巴結(jié)（圖2），CK5/6呈強陽性，陽性率為（73.9±7.1）%。HE染色顯示淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)未發(fā)生破壞，證明其為微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)［7］。定量分析18F-FDG攝取較低小鼠（4/6）的瘤周淋巴結(jié)，CK5/6陽性率為（10.1±4.7）%（P＜0.000 2）。此外，陽性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Glut-1陽性率為（51.9 ±11.5）%，明顯高于陰性淋巴結(jié)的（15.2±1.3）%（P＜0.01）。

圖2 組織病例特性鑒定A：腫瘤組織、陽性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)的H-E染色及免疫組織化學(xué)染色（×200）；B～C：不同組織中CK5/6（B）和Glut-1（C）的陽性表達率

3 討 論

前哨淋巴結(jié)活檢較多用于乳腺癌、黑色素瘤及子宮頸癌等的淋巴結(jié)分期、預(yù)后分析和決定是否進行淋巴結(jié)清掃［8］。該方法通常使用染料和（或）放射性藥物99mTc-SC在瘤周皮內(nèi)局部注射以定位前哨淋巴結(jié)，然后通過病理分析觀察其是否有轉(zhuǎn)移，如有轉(zhuǎn)移則進一步開展淋巴結(jié)清掃［9-11］。因此，這類“淋巴結(jié)顯像術(shù)”僅適用于前哨淋巴結(jié)定位，不能定性。雖然其定位準(zhǔn)確率達94%［12］，但識別淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移有賴于病理學(xué)檢查結(jié)果。此外，注射過量或注射壓力不當(dāng)會使區(qū)域淋巴結(jié)過量顯示，難以決定前哨淋巴結(jié)數(shù)量［13］。靜脈注射18F-FDG后全身PET/CT顯像，可發(fā)現(xiàn)較大的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，這些宏轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中通常葡萄糖代謝增高；而靜脈注射18F-FDG使放射性呈全身分布，微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)常因放射性攝入不足而難以顯示。

Thorek等［6］首次提出“正電子淋巴顯像”，證實可通過皮內(nèi)注射18F-FDG定位正常小鼠淋巴結(jié)位置，1 h后淋巴結(jié)ID%/g值為2～8，與本研究陰性淋巴結(jié)的ID%/g值（7.2±0.4）相當(dāng)。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)高攝取的原因，可能主要是局部注射后經(jīng)淋巴管進入淋巴結(jié)的放射性濃度遠高于靜脈注射法，從而容易顯示腫瘤細胞數(shù)量不多但葡萄糖代謝增高的微轉(zhuǎn)移，這一點與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)的Glut-1陽性率相吻合。

本研究建立的乳腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移模型證實，局部注射18F-FDG比靜脈注射能更好地顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，原位接種再手術(shù)去除部分瘤體的方法可促使淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)CK5/6結(jié)果證實轉(zhuǎn)移率約為33%（2/6），與局部皮內(nèi)注射18F-FDG成像判斷的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率一致。值得一提的是，只有陽性淋巴結(jié)有較高的18F-FDG攝取，其余瘤周陰性淋巴結(jié)則不然。目前，國外正在進行多項臨床試驗，以驗證不同注射方式（瘤內(nèi)、間質(zhì)注射等）下的“正電子淋巴顯像”效果（臨床試驗編號：NCT02285192），其結(jié)果將于近幾年公布。此外，“正電子淋巴顯像”可結(jié)合“切倫科夫成像”幫助術(shù)中清掃淋巴結(jié)［6］，但臨床上可能會遇到一些問題，如人體成像相對于動物實驗需更長采集時間，人體組織也可能對切倫科夫信號有干擾。因此，“正電子淋巴顯像”的臨床應(yīng)用尚需時日。

綜上所述，本研究構(gòu)建了小鼠乳腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移模型，對比不同注射方式（局部皮內(nèi)與靜脈注射）及不同顯像劑（18F-FDG與99mTc-SC）時瘤周淋巴結(jié)成像，發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)注射18F-FDG能更好地實現(xiàn)術(shù)前診斷乳腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。