高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠睪丸微血管損傷導(dǎo)致非感染性睪丸炎癥反應(yīng)*

張曉艷 李炳蔚 尚 飛 劉明明 劉淑英 盛有明 李宏偉 修瑞娟

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 微循環(huán)研究所 衛(wèi)生部微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100005）

由高脂飲食誘導(dǎo)的男性生精功能障礙受到廣泛關(guān)注[1-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，長期高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠睪丸內(nèi)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增高[6]，但高脂飲食對(duì)睪丸微血管的影響，以及睪丸微血管功能與高脂誘導(dǎo)的睪丸內(nèi)炎癥反應(yīng)的關(guān)系，報(bào)道較少。本研究利用高脂飲食建立C57BL/6雄性肥胖小鼠模型，觀察由高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠睪丸微血管病理生理改變與炎癥細(xì)胞在睪丸組織的浸潤以及生精細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)病理變化的關(guān)系，為進(jìn)一步探索高脂飲食誘導(dǎo)的雄性生殖功能損害機(jī)制提供依據(jù)。

材料與方法

一、儀器設(shè)備及主要試劑

羅氏血糖儀及配套血糖試紙（德國羅氏公司）；激光多普勒血流灌注監(jiān)測系統(tǒng)（Moor VMS-LDF，英國Moor公司產(chǎn)品）；石蠟切片機(jī)（RM2245，德國Leica公司產(chǎn)品）?？勾笫驝D31、F4/80單克隆抗體、山羊抗小鼠腫瘤壞死因子單克隆抗體（TNFα）及TNFα和MCP-1ELISA檢測試劑盒購于英國Abcam公司；TUNEL細(xì)胞原位凋亡檢測試劑盒（美國Roche公司）；檸檬酸緩沖液（北京康為世紀(jì)公司）；高脂飼料（D12492，為國際通用高脂飼料配方）及普通繁殖飼料均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所華阜康生物科技有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。SPF級(jí)7～8周雄性C57BL/6小鼠40只，質(zhì)量23～25g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所[SCXK(京)2009-0007]。經(jīng)過1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control, n=20）和高脂組（High fat diet, HFD, n=20）。對(duì)照組飼料為普通繁殖飼料，高脂組為高脂飼料（D12492，其中脂肪供能60%，碳水化合物供能20%,蛋白質(zhì)供能20%）。兩組動(dòng)物自由飲水取食，飼養(yǎng)于12 h明暗交替環(huán)境中，溫度22～23℃，濕度40%～60%，每周監(jiān)測體質(zhì)量和血糖。于喂養(yǎng)20周末，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。以激光多普勒血流灌注監(jiān)測系統(tǒng)檢測睪丸血流灌注量，后留取全血樣本。下腹部十字切口取兩只睪丸，稱量后分別于10%中性甲醛固定，置于凍存管中液氮速凍。

三、方法

（一） HE染色觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)變化

睪丸固定于中性甲醛8 h后，用5號(hào)針頭分別于睪丸兩端刺穿白膜（以利于固定液滲透于睪丸內(nèi)部，避免由于組織固定不良而導(dǎo)致染色信息不完整）。睪丸組織經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋后以5μm厚度切片。切片經(jīng)脫蠟水化后行伊紅染色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察睪丸組織病理變化。

（二）免疫組化法分析睪丸組織CD31、F4/80及TNFα表達(dá)情況

睪丸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2孵育10min，雙蒸水沖洗浸泡5min，檸檬酸鹽微波爐抗原修復(fù)10 min，室溫下自然冷卻。根據(jù)免疫組化試劑盒滴加一抗孵育，加相應(yīng)二抗，最后以DAB試劑盒顯色。陽性表達(dá)為棕黃色染色，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行累積吸光度分析抗原相對(duì)表達(dá)量。

（三）TUNEL染色法觀察小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡情況

睪丸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。切片置入pH6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中微波爐高溫加熱1min，迅速將切片移入20℃雙蒸水中冷卻，PBS浸洗。將適量TUNEL反應(yīng)混合物滴加在切片上，濕盒內(nèi)37℃孵育60min，PBS浸洗3次。切片滴加3%H2O2室溫10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗熒光素抗體，濕盒內(nèi)30min，PBS浸洗3次。加入DAB顯色液染色，凋亡生精細(xì)胞為棕色，自來水充分清洗玻片。蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，以中性樹膠封片。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行累積吸光度分析抗原相對(duì)表達(dá)量。

（四）ELISA定量檢測小鼠血及睪丸蛋白TNFα和MCP-1的表達(dá)水平

全血樣本于室溫冰塊上靜置1h，4℃ 3 000×g，15min離心，收集上清于-80℃保存待檢測。睪丸經(jīng)液氮速凍研磨粉碎。超聲勻漿，600×g、5min離心，取上清-80℃保存待檢測。根據(jù)ELISA檢測試劑盒的操作步驟定量檢測血及睪丸組織中TNFα和MCP-1細(xì)胞因子表達(dá)量。

（五）睪丸微循環(huán)血流灌注水平檢測

在造模結(jié)束當(dāng)日以1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，并使其仰臥固定于掃描臺(tái)。酒精消毒腹部皮膚，切開下腹部，輕提附睪周圍白色脂肪暴露睪丸。應(yīng)用Moor VMS - LDF VP4針式探針檢測小鼠睪丸微循環(huán)血流量。LDF監(jiān)測基帶帶寬15kHz，血流輸出量5V＝1000U，時(shí)間常數(shù)0.5s。單次掃描時(shí)間＞1.5min，時(shí)程約5min。通過Moor VMS PC 2.1軟件提取各時(shí)相的睪丸血流灌注水平（perfusion unit，PU），計(jì)算平均灌注量（PU/min）。

（六） 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組小鼠體質(zhì)量及血糖比較

高脂組小鼠經(jīng)高脂飲食20周后，體質(zhì)量增加顯著（45.00±3.00）g，與對(duì)照組（32.50±1.88）g 相比有顯著性差異（P＜0.01）；高脂組空腹血糖（9.96±1.57）mmol/L，顯著高于對(duì)照組的（5.32±1.16）mmol/L（P＜0.01），見圖1。同時(shí)，對(duì)照組小鼠睪丸外觀飽滿，白膜質(zhì)地柔韌，針刺時(shí)無阻力感；高脂組睪丸外觀色澤暗淡，白膜質(zhì)地韌度增高，針頭較難刺入。

圖1 高脂組與對(duì)照組小鼠體質(zhì)量及血糖的變化

二、兩組小鼠睪丸形態(tài)學(xué)及生精細(xì)胞凋亡水平染色

對(duì)照組小鼠睪丸HE染色結(jié)果顯示，生精上皮結(jié)構(gòu)完整，各級(jí)生精細(xì)胞排列有序，睪丸間質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密。高脂組小鼠睪丸生精上皮結(jié)構(gòu)紊亂，生精細(xì)胞之間排列松散，成熟生精細(xì)胞減少，無可見長型精子，生精小管萎縮；睪丸間質(zhì)膨大，細(xì)胞增多。TUNEL染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠睪丸僅可見個(gè)別凋亡生精細(xì)胞，IA值為（0.92±0.07）×107；而高脂組可見各級(jí)生精細(xì)胞凋亡， 且凋亡顯著，IA值為（1.87±0.13）×107，顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），且生精上皮有不同程度破壞，見圖2。

圖2 睪丸組織HE染色及生精細(xì)胞TUNEL表達(dá)水平 (×400, n=5)

三、兩組小鼠睪丸TNFα及F4/80表達(dá)水平

高脂組小鼠睪丸TNFα表達(dá)IA值為（5.95±0.14）×108顯著高于對(duì)照組[IA值為（0.57±0.05）×108]（P＜0.001），生精小管、睪丸間質(zhì)及微血管均有表達(dá)；高脂組睪丸間質(zhì)巨噬細(xì)胞表達(dá)IA值為（3.16±0.20）×107數(shù)量也顯著多于對(duì)照組IA值為（1.14 ± 0.13）×107（P＜0.01），主要分布在睪丸間質(zhì)微血管附近，見圖3。

四、血及睪丸組織中TNFα和MCP-1的含量

ELISA檢測結(jié)果顯示，高脂組血中及睪丸蛋白中TNFα（血對(duì)照組：796.00±165.00 pg/mL，高脂組：3900.00±236.00 pg/mL；睪丸勻漿control：1219.00±127.00 pg/mL，高脂組：9612.00±377 pg/mL）和MCP-1（血對(duì)照組：121.00±39.00 pg/mL，高脂組：490.00±53.00 pg/mL；睪丸勻漿對(duì)照組：129.00±29.00 pg/mL，高脂組：612.00±77.00 pg/mL）表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），見圖4。

五、睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)水平以及微血管血流灌注水平

與對(duì)照組[IA值為（2.41±0.15）×107]相比，高脂組睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31免疫組化染色表達(dá)缺失[IA值為(1.24±0.13)×107]（P＜0.05）。激光多普勒血流灌注監(jiān)測系統(tǒng)顯示，高脂組睪丸微血管血流灌注水平降低（對(duì)照組：557.40±135.00PU/min vs 高脂組：95.48±38.35 PU/min，t =10.92， P＜0.001），見圖5。

圖3 睪丸組織TNFα及F4/80免疫組表達(dá) (×400, n=5)

圖4 TNFα及MCP-1在血及睪丸蛋白中的表達(dá)量

圖5 小鼠睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)變化及微血管血流灌注水平(×400, n=5)

討 論

睪丸微循環(huán)參與維持睪丸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，是睪丸內(nèi)血液供應(yīng)、物質(zhì)代謝等重要生命活動(dòng)的場所[7]。微血管內(nèi)皮細(xì)胞是睪丸微血管的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)報(bào)道，高脂飲食可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷并進(jìn)一步誘發(fā)血管性疾病[8]，但高脂飲食對(duì)睪丸微血管的影響罕見報(bào)道。為了解高脂飲食誘導(dǎo)的睪丸微血管變化，本研究進(jìn)行了睪丸微血管免疫組化染色及睪丸微血管激光多普勒掃描檢測。結(jié)果顯示，高脂組睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)減少甚至缺失，睪丸微循環(huán)血流灌注水平降低，提示高脂組睪丸微血管受損。此外，本研究C57BL/6小鼠經(jīng)20周高脂飼養(yǎng)后，空腹血糖水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。常規(guī)組織學(xué)染色顯示，高脂組睪丸生精上皮出現(xiàn)空泡樣改變，成熟生精細(xì)胞減少，甚至無長形精子。TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂組各級(jí)生精細(xì)胞均有凋亡，提示高脂組生精上皮受損，生精細(xì)胞生成障礙。由于高血糖可致小鼠睪丸微循環(huán)受損并可間接誘導(dǎo)生精功能障礙[9]，因此本研究認(rèn)為高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血糖增高是高脂小鼠睪丸微血管損傷的促發(fā)因素之一。

以往的研究主要針對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)男性生殖的不良影響[10]。而最近有學(xué)者提出男性肥胖閹割理論（GELDING theory of male hypogonadism）[11]，其關(guān)鍵論點(diǎn)在于：高脂飲食對(duì)男性生殖的損害是由于高脂飲食產(chǎn)生的腸源性內(nèi)毒素刺激并損傷血-腸黏膜屏障，內(nèi)毒素由腸道入血，使體內(nèi)相關(guān)免疫系統(tǒng)被激活，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，可直接或間接損傷男性生精功能。另有文獻(xiàn)報(bào)道，腸源性內(nèi)毒素血癥是高脂誘導(dǎo)的全身性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素[12]。基于以上腸源性內(nèi)毒素理論，本研究推測，高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血糖增高損傷睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞，使睪丸微血管功能受損；由于睪丸微血管是血睪屏障的重要組成部分[13]，微血管損傷可能破壞血睪屏障完整性，使高脂誘導(dǎo)的內(nèi)毒素通過受損的血睪屏障進(jìn)入生精小管并損傷生精細(xì)胞。因此下一階段，將完善高脂飲食誘導(dǎo)的體內(nèi)內(nèi)毒素表達(dá)水平測定及內(nèi)毒素對(duì)睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞及生精細(xì)胞影響的相關(guān)研究，以進(jìn)一步論證男性閹割理論中內(nèi)毒素對(duì)雄性生殖的影響。

內(nèi)毒素有效成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是體內(nèi)特異性炎癥受體（toll like receptors，TLRs）的配體[14]，LPS激活TLRs后活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB并激活下游與炎癥相關(guān)的基因分泌TNFα等一系列炎癥細(xì)胞因子[15-19]。最近也有文獻(xiàn)報(bào)道，高脂飲食可誘導(dǎo)發(fā)育前期肥胖大鼠睪丸內(nèi)炎癥細(xì)胞增多[20]，因此筆者檢測了小鼠血中及睪丸組織勻漿中炎癥因子TNFα和MCP-1 水平以及睪丸巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物F4/80的表達(dá)水平。結(jié)果顯示高脂組血中及睪丸組織勻漿中炎癥因子TNFα和MCP-1 水平均顯著增高。由此我們推測，由腸道入血的腸源性內(nèi)毒素進(jìn)入睪丸微血管系統(tǒng)，激活了睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞上與炎癥相關(guān)的TLRs受體分泌釋放TNFα、MCP-1等炎癥因子。由于TNFα在誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)方面具有重要的生物活性，能刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞再次合成和分泌炎癥因子[21]，可能進(jìn)一步加劇了睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。此外，TNFα、MCP-1等炎癥細(xì)胞因子可能通過損傷的微血管滲透或擴(kuò)散進(jìn)入睪丸生精小管或睪丸間質(zhì)，MCP-1可募集睪丸內(nèi)炎癥細(xì)胞[22]，使炎癥細(xì)胞在睪丸聚集并發(fā)生免疫炎性反應(yīng)，形成非感染性睪丸炎[23]。本研究結(jié)果顯示，高脂組睪丸內(nèi)F4/80表達(dá)增多；巨噬細(xì)胞免疫炎性反應(yīng)可繼續(xù)釋放炎癥細(xì)胞因子，又將加劇對(duì)生精細(xì)胞的損傷，可能最終致雄性不育[23]。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠血糖水平升高導(dǎo)致睪丸微血管損傷；由高脂飲食產(chǎn)生的腸源性內(nèi)毒素可能激活了睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞上與炎癥相關(guān)的TLRs受體，釋放炎癥因子；炎癥細(xì)胞因子通過損傷的微血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透進(jìn)入睪丸實(shí)質(zhì)，募集炎癥細(xì)胞在睪丸間質(zhì)聚集，致睪丸內(nèi)發(fā)生非感染性炎癥反應(yīng)，并再次釋放炎癥細(xì)胞因子，后者通過受損的血睪屏障進(jìn)入生精小管，損傷生精細(xì)胞，最終引發(fā)雄性生殖功能障礙。通過糾正高脂飲食誘導(dǎo)的血糖增高對(duì)睪丸微血管的損傷，減輕睪丸內(nèi)非感染性炎癥反應(yīng)，可能成為臨床針對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的男性生精功障礙的治療靶點(diǎn)之一。