一種枇杷真菌病害的分子鑒定

楊金燕 楊亞曦 王肸芃

摘 要：本實驗通過對貴陽市開陽縣采集的枇杷灰斑病害標本在實驗室采用組織分離方法進行了病原分離純化，借助形態(tài)學特征對病原菌進行了初步的鑒定，結(jié)合對病原菌DNA進行PCR 擴增和序列測定，結(jié)果鑒定枇杷灰斑病的病原菌為半知菌亞門的枇杷擬盤多毛孢 [Pestalotiopsis eriobotryfolia （Guba） Chen et Chao]。

關鍵詞：枇杷真菌病害；病原菌分離純化；分子鑒定

近年來，貴陽枇杷果樹產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，枇杷灰斑病趨于嚴重，明顯影響枇杷的品質(zhì)和產(chǎn)量?；野卟∈氰凌巳~斑病中最嚴重的病害，該菌既能為害嫩梢、嫩葉，還能為害花穗、花和果實，一年四季均能危害。鑒于此，本實驗對該病原菌進行鑒定，以期為該病害的綜合防治提供依據(jù)。為了快速準確的鑒定病原菌，本實驗將利用PCR擴增、ITS等分子生物學檢測技術進行鑒定。

一、材料與方法

1.材料。2017年7月從貴陽市開陽縣采取枇杷灰斑病病葉帶回實驗室。

2.病原菌分離和純化。病葉組織表面消毒后，切取其中病健交界處的葉片組織，移在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待培養(yǎng)物長出，切取或挑培養(yǎng)物邊緣較純的部分于新的平板培養(yǎng)基上，如此反復幾次，得到病原菌的純培養(yǎng)。

3.病原菌的鑒定。借助形態(tài)學的特征初步鑒定，再采取分子鑒定方法通過DNA的提取、PCR 技術、電泳及測序等準確鑒定病原菌。

二、結(jié)果與分析

1.枇杷灰斑病癥狀

灰斑病主要危害葉片，病斑初期呈黃色褪綠小點，逐漸擴大成淡褐色圓形病斑，后漸變?yōu)榛野咨蚧尹S色。病斑邊緣明顯，為較窄的黑褐色環(huán)帶，其上散生粗而稀疏的黑色小點（分生孢子盤）。后期病斑繼續(xù)擴大，病斑多時融合成不規(guī)則大斑塊。典型病葉上的分生孢子器呈盤狀，散生或聚生，初期埋生于表皮中，后突破表皮，呈黑色。枝上病斑有流膠型和干枯型兩類，癥狀都與枝干腐爛病相似，發(fā)生部位有根頸、主干、側(cè)枝等。流膠型病斑有軟腐和流膠現(xiàn)象。干枯型病斑使樹皮干枯、開裂、撬起、嚴重剝落。侵害果實的病斑，圓形，紫褐色，明顯凹陷，上散生小黑點（見圖2.1）。

2.枇杷灰斑病的病原菌鑒定

（1）形態(tài)學特征。在營養(yǎng)充足的情況下，在PDA培養(yǎng)基上枇杷灰斑病病原菌生長8天即可長滿直徑為9cm培養(yǎng)皿，菌落邊緣平整，菌絲為白色或無色，菌落呈現(xiàn)出很明顯的輪紋狀（見圖2.2 A），菌落的背面會呈現(xiàn)淡黃色（見圖2.2 B）。分生孢子盤扁平，大小0.5 × 0.09mm ，黑漆狀（見圖2.2 C），分生孢子盤中堆積著大量的分生孢子（見圖2.2 D）。分生孢子紡錘形，具4個隔膜，兩端細，中間2、3個細胞黑色至黑褐色，兩端的1 – 2個細胞淡褐色。孢子大小24 ?m × 9 ?m，頂端細胞上生有2 - 3根附屬絲（個別有4根）（見2.2 E，F(xiàn)，G）。

（2）分子鑒定。枇杷灰板病病原菌ITS測序結(jié)果：

CATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAGGTTACCTGGTACCTGGAGACAGGTTACCCTGTAGCAGCTGCCGGTGGACTACTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATTTACAGTTATGTAATTCCTGAAATACAACGGCGGATCTGTGGTATCCTCTGAGCGTAGTAAATTATTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCAGCTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT

上述序列經(jīng)Blast并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較，鑒定結(jié)果為：枇杷擬盤多毛孢[P. eriobotryfolia （Guba） Chen et Chao]。

三、 結(jié)論與討論

本實驗采用常規(guī)分離方法和單孢分離法進行了病原分離純化，借助形態(tài)學特征對病原菌進行了初步的鑒定，并通過ITS-PCR技術進行進一步的研究。結(jié)果表明枇杷灰斑病的病原為枇杷擬盤多毛孢[P. eriobotryfolia （Guba） Chen et Chao]。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，枇杷灰斑病的發(fā)生與樹勢的強弱、果園管理以及氣候密切相關，且病菌全年可多次侵染，尤其是春梢、秋梢的發(fā)病較重。因此，應結(jié)合栽培管理等農(nóng)業(yè)措施和藥劑防治進行綜合防控。

傳統(tǒng)上我們對真菌病害的診斷仍依據(jù)對病癥和病原菌的觀察，受人為因素和環(huán)境條件干擾較大，而且耗時長，不適合快速鑒定的要求。隨著分子生物學及其相關學科的迅速發(fā)展，各種分子標記技術已被應用于多種真菌的鑒定工作中。尤其是PCR擴增和ITS技術的迅速發(fā)展及廣泛應用為植病診斷技術提供了重要的研究方法和技術手段。從目前來看，雖然傳統(tǒng)診斷方法仍然占主導地位，分子診斷方法大多數(shù)仍停留在實驗室水平，但分子診斷技術因其擁有快速、準確、特異、靈敏等優(yōu)點已經(jīng)在實際中得到了應用，應用ITS-PCR技術對單一病原菌診斷和應用DNA芯片技術對混合病原菌診斷是未來植物病原真菌分子診斷技術的發(fā)展方向，但從目前來看，要想實現(xiàn)對植物病原真菌的精確診斷還需將傳統(tǒng)方法和分子方法相結(jié)合。