HPLC法測定畜禽肉中喹諾酮類多種藥物殘留

劉海琴

（鶴壁市畜產品質量監(jiān)測檢驗中心，河南鶴壁 458000）

1 方法原理

畜禽肉（雞肉）中殘留的氟喹諾酮類藥物（環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星）用磷酸鹽緩沖液提取，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，流動相洗脫后。用液相色譜-熒光檢測器測定，外標法定量。

2 儀器與試劑

安捷倫1100液相色譜儀-配熒光檢測器，

分析天平 感量0.00001g.

R-201旋轉蒸發(fā)儀，

VX-2渦旋振蕩器，

Eppendorf移液器（成套），3～30k高速冷凍離心機，固相萃取裝置， HLB固相萃取柱.

3 實驗部分

3.1 試劑的配制

（1）磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水溶解并稀釋500ml，用5.0mcl/ml氫氧化鈉溶液調節(jié)（pH=7.0）

（2）磷酸/三乙胺溶液（0.05mcl/l）取85%磷酸3.4 ml，用水稀釋至1000ml，用三乙胺調節(jié)pH=2.4.

3.2 標準工作液的配制

（1）分別稱取鹽酸環(huán)丙沙星、甲磺酸達氟沙星、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星對照品各約25mg，精密稱定，分別于25ml棕色容量瓶中，用0.03mcl/l氫氧化鈉溶液稀釋成濃度分別為1mg/ml的儲備液。（達氟沙星儲備液濃度配制成0.2mg/ml）

（2）混合標準中間液 分別量取1mg/ml（0.2mg/ml）的儲備液各0.1ml于50ml容量瓶中，用流動相稀釋成濃度為2μg/ml（0.4ug/ml）的混合標準中間液。

3.3 方法步驟

3.3.1 質量控制樣品的制備

（1）空白樣品：取空白試樣，與待測樣品同步處理。

（2）添加樣品：取空白樣品，添加2μg/ml（0.4μg/ml）的混合標準中間液0.1ml，制的濃度為100μg/kg的陽性添加試料，與待測樣品同步處理。

3.3.2 提取

（1）取勻漿的試料2±0.02g，置50ml離心管中，加磷酸鹽緩沖液10.0ml，渦旋混合，中速震蕩5min，14000r/min離心10min，傾取上清液。（磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水溶解并稀釋500ml，用5.0mcl/ml氫氧化鈉溶液調節(jié)pH=7.0）

（2）用磷酸鹽緩沖液10.0ml重復提取一次。合并兩次上清液，備用。

3.3.3 凈化

（1）固相萃取柱依次用甲醇2ml，磷酸鹽緩沖液2ml預洗。

（2）取上述備用液體5.0ml過柱。

（3）用水2ml洗柱，擠干。

（4）用流動相2.0ml洗脫，收集，擠干，渦旋混合。過0.22μm微孔濾膜，供上機測定。

3.3.4 系列標準工作液的制備

精密量取混合標準中間工作液，用流動相稀釋成濃度為5、

10、20、50 、100、200、500ng/ml的系列標準工作液。系列標準工作溶液按表1配制。

表1 系列標準工作溶液配制

3.4 儀器色譜條件

色譜柱：C18（4.6×150mm 5μm）；

柱溫：30℃；

流動相：0.05mcl/l磷酸溶液/三乙胺-乙腈（87+13）；

流速：1.0ml/min；

進樣量：20μl；

檢測波長：激發(fā)波長280nm；發(fā)射波長450nm。

20ng/ml 標準溶液中氟喹諾酮類藥物色譜圖

100μg/kg空白雞肉添加試樣中氟喹諾酮類藥物色譜圖

3.5 結果分析

3.5.1 線性范圍

取濃度為5～500ng/ml 氟喹諾酮類藥物系列標準工作液進樣，以峰面積為縱坐標，以藥物濃度為橫坐標繪制標準工作曲線。結果表明（見表1），在5～500ng/ml系列標準工作液濃度范圍內，喹諾酮類藥物峰面積與濃度呈良好的線性關系。

表2 喹諾酮類藥物的線性方程、相關系數(shù)

3.5.2 準確度和精密度的測定

稱取同一來源的空白雞肉樣品3份，每份2.0g，分別添加2μg/ml（0.4μg/ml）的喹諾酮類藥物溶液0.1ml，制備濃度為100μg/kg（達氟沙星20μg/kg）的陽性樣品，按本方法測定，計算回收率在73.1%～84.54%，標準偏差在1.84%～5.4%，表明本方法重復性較好，具體結果見表3。

表3 喹諾酮類藥物的回收率試驗結果

4 實驗結論

實驗表明，雞肉樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取后，經(jīng)固相萃取柱凈化后，采用液相-熒光檢測器法測定，外標法定量，回收率為73.1%～84.5%，相對標準偏差為1.8%～5.4%（n=3）.本方法系列標準工作液濃度范圍內，喹諾酮類藥物峰面積與濃度呈良好的線性關系，準確度好、近年以來經(jīng)過對各類動物組織檢測的結果表明，該方法具有簡便、快速、靈敏、準確的特點，可滿足市級檢測單位對動物組織中4種喹諾酮類藥物殘留日常檢測需要。