外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3基因CNS2去甲基化與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

李子祺 葛鴻慶 王君鰲 王慧敏 胡杏平 陳文治

廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院骨科（廣州510120）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporo?sis，PMO）是指絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，導(dǎo)致骨吸收-骨形成失衡，出現(xiàn)以骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾?。?-3］。PMO患者骨骼中骨小梁的強(qiáng)度、密度和數(shù)量發(fā)生顯著的改變，其血液循環(huán)及骨髓腔內(nèi)的微環(huán)境中的炎癥相關(guān)細(xì)胞及促炎癥細(xì)胞因子的數(shù)量與成分也顯著提高。在炎癥狀態(tài)下，多種免疫細(xì)胞可通過釋放炎癥因子促進(jìn)破骨細(xì)胞形成［4］。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）是CD4+T細(xì)胞的重要亞群，在多種自身免疫性疾病中起到抑制炎癥作用［5］。大量研究［6-11］表明Treg細(xì)胞通過抑制破骨細(xì)胞活性進(jìn)而參與了骨代謝調(diào)節(jié)。Foxp3基因保守非編碼序列2（conserved noncoding sequence 2，CNS2）的低甲基化狀態(tài)是Treg細(xì)胞分化并發(fā)揮免疫抑制功能的前提［5，12-13］。本研究觀察了PMO患者外周血CD4+T細(xì)胞中Foxp3 CNS2去甲基化水平，及其與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年7月至2015年7月我院收治的PMO患者42例為觀察組，38例絕經(jīng)后骨量正常婦女作為對照組，記錄入組病例年齡、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)指數(shù)等一般資料。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) PMO的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)［3］，DXA測定骨密度值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值不足1個標(biāo)準(zhǔn)差為正常（T值≥-1.0 SD）；降低1～2.5個標(biāo)準(zhǔn)差為骨量低下或骨量減少（-2.5 SD＜T值＜-1.0 SD）；降低程度≥2.5個標(biāo)準(zhǔn)差為骨質(zhì)疏松（T值≤-2.5 SD）；降低程度符合骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時伴有一處或多處骨折為嚴(yán)重骨質(zhì)疏松。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)，絕經(jīng)后婦女DXA測定骨密度測定中T值≤-2.5 SD則診斷為PMO，納入觀察組。絕經(jīng)后婦女T值≥-1.0 SD則納入對照組。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并可能影響骨代謝的內(nèi)分泌疾病，如糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀旁腺功能亢進(jìn)等；（2）罹患慢性胃炎、腸炎、派杰氏病，以及骨與其他組織惡性腫瘤患者；（3）合并肝腎功能異常；（4）合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等免疫性疾?。唬?）6個月內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素或其他影響骨代謝的藥物；（6）1年內(nèi)出現(xiàn)骨折或其他原因?qū)е碌倪\動障礙的患者。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清Ⅰ型前膠原氨基端前肽（P1NP）、β膠原特殊序列（β?crosslaps）及血Ca2+測定 所有患者清晨空腹抽取靜脈血2 mL，利用美國Bio?Rad酶聯(lián)免疫檢測儀測定骨代謝生化標(biāo)志物P1NP、β?crosslaps，試劑盒由武漢云克隆科技股份有限公司提供。使用美國羅氏公司生產(chǎn)的Cobas 8000酶標(biāo)儀檢測血Ca2+，試劑盒由中國中生北控生物科技有限公司提供。

1.3.2 外周血CD4+T細(xì)胞分離 將抽取的新鮮抗凝血轉(zhuǎn)移至15/50 mL離心管內(nèi)，按每1 mL全血加入 50 μL 的比例加入 Human CD4+T cell Enrich?ment Cocktail（Stemcell，15022），輕輕混勻。室溫靜置20 min。向離心管內(nèi)加入等體積含2%FBS的PBS混勻，稀釋血液。將稀釋的血液滴加至淋巴細(xì)胞分離液液面上。于室溫1 200 g離心20 min；小心從分離液：血漿中間層吸取富集的CD4+T細(xì)胞至一新離心管內(nèi)。用PBS+2%FBS洗滌細(xì)胞1次。重復(fù)此步驟1次。加RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS+1%Pen/Strep）重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 實時定量PCR檢測外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá) 使用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA（試劑盒DBI?2220），以GAPDH為內(nèi)參基因，行實時定量PCR法（試劑盒Genecopies，AOPR?1200），F(xiàn)oxp3正義引物5′?CA?CTCACCTCACTCCCATTC?3′，反義引物 5′?GGGCC?TTGGATCCCAAATAA?3′。PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸35 s，共40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)檢測兩次。Foxp3 mRNA相對表達(dá)量以2-△△Ct表示。

1.3.4 亞硫酸氫鹽測序法檢測外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3 CNS2甲基化 按照DNA提取試劑盒（Tian?gen，DP304）說明書進(jìn)行操作，對所提取DNA進(jìn)行定量分析后嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，取基因組DNA 1 μg進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化并純化回收。引物信息B281?F：TTGGGTTAAGTTTGTTGTAGGATAG；B281?R：ACATCTAAACCCTATTATCACAACC。在50 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR Mix 25 μL，上下游引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，補(bǔ)水至 50 μL。PCR產(chǎn)物純化按照試劑盒中的產(chǎn)品說明操作，將目標(biāo)片段割膠純化（Generay，cat：GK2043）。采用Generay的pTG19?T作為載體，按照試劑盒中的產(chǎn)品說明操作，轉(zhuǎn)化采用XL10?Gold感受態(tài)，按照產(chǎn)品說明進(jìn)行轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇和涂板。酶切法鑒定陽性菌落挑取質(zhì)粒送測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，組間比較分別采用獨立樣本t檢驗或 Mann?WhitneyU檢驗；Pear?son相關(guān)性檢驗分析PMO中骨代謝指標(biāo)與CD4+T細(xì)胞Foxp3 mRNA相對表達(dá)量、Foxp3 CNS2去甲基化的關(guān)系。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 觀察組共納入PMO患者42例，平均年齡（57.9±7.5）歲；對照組納入絕經(jīng)后無骨質(zhì)疏松癥患者38例，平均年齡（56.0±5.0）歲。兩組患者年齡、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)指數(shù)等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 兩組患者外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3 mRNA相對表達(dá)量、Foxp3 CNS2去甲基化率比較 觀察組Foxp3 mRNA相對表達(dá)量0.9±0.3，顯著低于對照組1.8±0.6，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（z=-7.1，P＜0.01）。觀察組Foxp3 CNS2去甲基化率為（7.3±1.3）%，顯著低于對照組（9.6±1.4）%，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-7.4，P＜0.01）。根據(jù)Pearson相關(guān)性分析，所有患者外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3 CNS2位點非甲基化率與Foxp3 mRNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)，其相關(guān)性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.5，P＜0.01）。見圖1。

表1 兩組患者一般資料對比Tab.1 Comparison of demographic characteristics between two groups ±s

表1 兩組患者一般資料對比Tab.1 Comparison of demographic characteristics between two groups ±s

組別觀察組對照組t值P值例數(shù)42 38年齡（歲）57.9±7.5 56.0±5.0 1.3 0.2身高（m）1.5±0.1 1.6±0.1-1.6 0.1體質(zhì)量（kg）63.3±8.1 63.2±7.4 0.1 0.9體質(zhì)指數(shù)26.5±3.5 25.7±3.7 1.0 0.3

圖1 PMO患者外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3基因CSN2去甲基化程度比較Fig.1 Comparison of DNA methylation of Foxp3 CNS2 region in CD4+T cells between patients with postmenopausal osteoporosis and control group

2.3 PMO中骨代謝指標(biāo)與CD4+T細(xì)胞Foxp3 mRNA相對表達(dá)量、Foxp3 CNS2去甲基化的關(guān)系 觀察組與對照組血清PINP含量分別為（43.6±4.0）ng/mL與（24.0±3.6）ng/mL，觀察組PINP含量顯著高于對照組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=23.6，P＜0.01）。觀察組血清β?crosslaps含量（1.2±0.2）ng/mL，顯著高于對照組（0.8±0.1）ng/mL，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（z=6.7，P＜0.01）。觀察組與對照組血鈣含量分別為（2.4±0.2）mmol/L及（2.4±0.1）mmol/L，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.2，P=0.2）。根據(jù)Pearson相關(guān)性分析，PMO中外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3 CNS2位點非甲基化率與β?crosslaps呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.5，P＜0.01）；CD4+T細(xì)胞Foxp3 CNS2位點非甲基化率與血清PINP含量無顯著的相關(guān)性（r=-0.1，P=0.6）；CD4+T細(xì)胞Foxp3 mRNA相對表達(dá)量與血清PINP（r=-0.2，P=0.2）、β?crosslaps含量（r=-0.1，P=0.6）均無顯著的相關(guān)性。

3 討論

絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，導(dǎo)致骨代謝中破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收作用增強(qiáng)，與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成作用失衡，最終導(dǎo)致了骨質(zhì)疏松癥。正常人體中90%的骨基質(zhì)由Ⅰ型膠原組成。骨代謝指標(biāo)PINP由成骨細(xì)胞分泌，是I型膠原形成的重要的代謝產(chǎn)物，與骨形成密切相關(guān)；而β?crosslaps是Ⅰ型膠原分解的產(chǎn)物，可作為骨吸收的重要指標(biāo)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)PMO患者外周血CD4+T細(xì)胞中Foxp3 CNS2位點去甲基化顯著降低，并且與血清中β?crosslaps含量呈負(fù)相關(guān)。這提示在PMO中Treg細(xì)胞可能通過抑制骨吸收作用參與骨代謝調(diào)節(jié)。

Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的重要亞群，可通過細(xì)胞間直接接觸以及TGF?β、IL?4、IL?10等因子介導(dǎo)的間接途徑抑制破骨細(xì)胞，從而在骨代謝平衡中起到骨保護(hù)作用［9-10］。李文艷等［6］通過臨床研究發(fā)現(xiàn)在老年性骨質(zhì)疏松癥患者中外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量隨著年齡的增長而降低，推測Treg細(xì)胞的減少促進(jìn)了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。而動物實驗發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例與骨質(zhì)疏松大鼠骨密度呈正相關(guān)［7］。

Foxp3是Treg細(xì)胞區(qū)別于其他CD4+T細(xì)胞的特異性基因，其穩(wěn)定表達(dá)是Treg細(xì)胞發(fā)揮骨保護(hù)作用的前提。ZAISS等［11］研究發(fā)現(xiàn)Foxp3轉(zhuǎn)基因小鼠（Foxp3?tg）的骨髓細(xì)胞能夠抑制腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)由炎癥因子介導(dǎo)的骨破壞。LIU等［15］研究發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的大鼠模型中Treg細(xì)胞數(shù)量顯著低于假手術(shù)組，而在脾及股骨局部的Foxp3蛋白表達(dá)顯著降低。越來越多的文獻(xiàn)表明，表觀遺傳因素與Foxp3的表達(dá)、Treg細(xì)胞分化與功能維持密切相關(guān)。其中Foxp3 CNS2去甲基化是Treg細(xì)胞特異的表觀遺傳標(biāo)記［12］，也是Foxp3穩(wěn)定表達(dá)的前提［13］。

本研究采用Foxp3 CNS2去甲基化程度來反應(yīng)Treg細(xì)胞數(shù)量與功能，是因為部分CD4+T細(xì)胞能夠短暫地表達(dá)Foxp3，但并不具備類似Treg細(xì)胞的免疫抑制功能［16］。而少量Treg前體細(xì)胞Foxp3 CNS2位點去甲基化后即可獲得免疫抑制功能，即使暫無Foxp3表達(dá)［17］。因此相對于Foxp3基因mRNA的表達(dá)，F(xiàn)oxp3 CNS2去甲基化程度是反應(yīng)外周血CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例的可靠指標(biāo)，更為準(zhǔn)確地反應(yīng)了Treg細(xì)胞對骨吸收的抑制作用。本研究結(jié)果也印證了這一推論，雖然PMO患者中CD4+T細(xì)胞Foxp3 CNS2去甲基化程度與Foxp3基因mRNA的表達(dá)均顯著降低，但僅Foxp3 CNS2去甲基化程度與血清中β?crosslaps含量具有顯著負(fù)相關(guān)性。

本研究具有一定的局限性。本研究納入了42例PMO患者與38例絕經(jīng)后無PMO婦女進(jìn)行對照，由于PMO的發(fā)生與發(fā)展受多種因素影響，本研究的樣本數(shù)需進(jìn)一步擴(kuò)大，并通過多因素分析探討Foxp3 CNS2去甲基化水平與PMO的關(guān)系。另一方面，本研究為橫斷面研究，F(xiàn)oxp3 CNS2去甲基化水平與疾病發(fā)生發(fā)展的動態(tài)關(guān)系尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PMO外周血中CD4+T細(xì)胞中Foxp3 CNS2去甲基化水平顯著降低，且與血清β?crosslaps含量呈負(fù)相關(guān)?？梢奝MO中外周血中CD4+T細(xì)胞Foxp3 CNS2去甲基化水平是與骨代謝關(guān)系密切的生物標(biāo)志，可能反應(yīng)了Treg細(xì)胞對骨吸收的抑制作用。