上調(diào)海馬miR?107水平改善阿爾茨海默病模型鼠學(xué)習(xí)記憶損傷

王雪銀 李宜培

河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微生物與免疫學(xué)教研室（鄭州 451191）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，能夠通過和靶基因mRNA的3′UTR段結(jié)合抑制其蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)揮作用［1］。人源miR?107最早被證實(shí)作為一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子參與糖的代謝［2］。近來的研究表明miR?107在早期的阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）患者腦中表達(dá)下降，與AD特征性的病理特征神經(jīng)纖維纏結(jié)和炎性斑塊的水平呈負(fù)相關(guān)［3］，并且miR?107還能通過調(diào)控淀粉樣蛋白剪切酶BACE1的功能，加劇AD患者的記憶力損傷［4］。此外，β淀粉樣蛋白（amyloid β?protein，Aβ）轉(zhuǎn)基因小鼠的研究證實(shí)miR?107參與了絲氨酸蛋白水平的調(diào)節(jié)和棒狀結(jié)構(gòu)的形成［5］。以上的研究結(jié)果說明miR?107可能參與了AD的病理過程，影響了其學(xué)習(xí)記憶能力，但是具體的分子機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。為了探討miR?107在AD病理過程中的具體機(jī)制以及對(duì)AD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，本研究利用立體定位注射系統(tǒng)在AD模型鼠海馬區(qū)上調(diào)miR?107的表達(dá)水平，并檢測(cè)其對(duì)AD模型鼠突觸相關(guān)蛋白NMDA受體2B（NR2B）和谷氨酸受體1（GluR1）以及學(xué)習(xí)記憶損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 miR?107表達(dá)慢病毒顆粒有本室包裝和保存。293FT（人胚腎細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)ATCC中心，由本室傳代并保存。IMDM（含GlutaMAX）、FBS、MEM Non?Essential Amino Acids（NEAA）、GlutaMAX I、TrypLE express、雙抗、Neurobasal、B27購(gòu)自Gbico公司，NR2B一抗、GAPDH抗體購(gòu)自Ab?cam公司。BCA蛋白測(cè)定試劑盒，免疫印跡的二抗Odyssey Second antibody購(gòu)自Pierce公司。硝酸纖維素膜（NC）購(gòu)自Hybond公司，轉(zhuǎn)基因小鼠墊料食物購(gòu)自北京華阜康。AD模型鼠由本室飼養(yǎng)保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及病毒注射 選取6～8個(gè)月齡的雄性AD模型鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為miR?107表達(dá)病毒組（病毒組）和空載體病毒組（對(duì)照組）。利用腦立體定位技術(shù)，采用微量注射系統(tǒng)將病毒顆粒注射AD鼠雙側(cè)海馬區(qū)域，2周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 定量PCR Trizol法提取AD模型鼠海馬組織的總RNA，超微量全波長(zhǎng)分光光度測(cè)RNA濃度及純度，1%的瓊脂糖凝膠電泳確定RNA形態(tài)之后，用 All?in?One First?strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 mRNA 的 cDNA，然后用 All?in?One miRNA qRT?PCR Detection Kit進(jìn)行Real Time PCR檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平，以U6 snRNA為內(nèi)參，2-ΔΔCT對(duì)樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.2.3 Western blot 病毒感染2周后分別提取病毒組和對(duì)照組小鼠海馬組織蛋白，常規(guī)處理蛋白樣品后，取兩組蛋白樣品各30 μg進(jìn)行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離后的蛋白采用半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，NR2B和GluR1的一抗4℃進(jìn)行孵育過夜，二抗室溫避光孵育，洗膜3次后Odensey激光紅外掃描儀掃膜檢測(cè)蛋白水平。

1.2.4 Morris水迷宮 病毒感染2周后，采用Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為定位航行訓(xùn)練6 d，休息1 d，第7天空間搜索檢測(cè)。設(shè)定潛伏期為90 s，定位航行階段記錄潛伏期，空間搜索階段記錄穿越平臺(tái)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組，每組15只動(dòng)物。病毒組為AD模型鼠海馬區(qū)注射miR?107病毒；對(duì)照組為AD模型鼠海馬區(qū)注射空載體對(duì)照病毒。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒上調(diào)AD模型鼠海馬區(qū)miR?107水平為了檢測(cè)感染病毒后AD模型鼠的miR?107水平，利用定量PCR法檢測(cè)了病毒感染2周后兩組小鼠海馬組織的miR?107的水平。定量PCR結(jié)果示，與對(duì)照組比較，病毒組AD鼠海馬區(qū)miR?107的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖1）。上述結(jié)果證實(shí)可以通過海馬區(qū)注射miR?107過表達(dá)慢病毒顆粒，有效地上調(diào)AD模型鼠腦內(nèi)的miR?107水平。

圖1 定量PCR法檢測(cè)病毒感染后AD鼠海馬區(qū)miR?107的表達(dá)水平Fig.1 The expression of miR?107 in hippocampus of AD mice was detected by quantitative PCR after virus infection

2.2 上調(diào)海馬miR?107增加突觸相關(guān)蛋白水平為了檢測(cè)miR?107對(duì)AD模型鼠突觸相關(guān)蛋白的影響，利用過表達(dá)病毒上調(diào)了海馬區(qū)miR?107水平后，檢測(cè)了NR2B和GluR1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，上調(diào)海馬區(qū)miR?107水平后，病毒組AD模型鼠海馬區(qū)NR2B和GluR1的蛋白水平顯著上調(diào)（圖2）。NR2B和GluR1的表達(dá)水平對(duì)于學(xué)習(xí)記憶的功能具有重要作用，所以上述結(jié)果提示增加的NR2B和GluR1可能參與miR?107影響學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制。

2.3 上調(diào)miR?107減輕AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶障礙 為了確認(rèn)上調(diào)海馬區(qū)miR?107水平對(duì)AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響，利用Morris水迷宮的方法檢測(cè)了病毒組和對(duì)照組AD模型鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，上調(diào)海馬區(qū)miR?107水平后，病毒組AD模型鼠在學(xué)習(xí)階段的潛伏期顯著縮短，說明其學(xué)習(xí)的能力明顯增強(qiáng)（圖3A）。而在穿越平臺(tái)的次數(shù)檢測(cè)中同樣顯示了記憶能力的明顯改善，與對(duì)照組相比，病毒組AD模型鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯增加（圖3B）。

圖2 免疫印跡檢測(cè)上調(diào)miR?107后NR2B、GluR1的表達(dá)水平Fig.2 The expression of NR2B and GluR1 were tested by Western blot after miR?107 was upregulated

圖3 Morris水迷宮檢測(cè)Tg2576小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力（n=15）Fig.3 The spatial learning and memory of Tg2576 mice detected by Morris water maze test

3 討論

AD是一種極大危害人類健康的神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為記憶障礙、人格和行為異常，最顯著的病理變化包括神經(jīng)纖維纏結(jié)［6］、淀粉樣蛋白變性［7］、神經(jīng)和血管的大量丟失［8］和血腦屏障完整性損傷［9］等。臨床上一直缺乏有效的治療藥物，而各個(gè)研究機(jī)構(gòu)開發(fā)的一系列新的有望改善AD病理變化的靶點(diǎn)藥物，包括小分子的siRNA和miRNA藥物［10］。

miRNA屬于非編碼RNA，其作用方式是和靶蛋白的mRNA 3′UTR端互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致蛋白表達(dá)抑制或者mRNA降解，由于其能夠通過調(diào)控多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平而參與疾病的病理過程成為近年來研究的熱點(diǎn)［11］。研究表明AD患者腦脊液中的部分miRNA的表達(dá)會(huì)發(fā)生明顯的異常［12］。miRNA對(duì)AD發(fā)生發(fā)展的影響涉及到對(duì)APP、BACE1、神經(jīng)元的凋亡等多環(huán)節(jié)的調(diào)控作用［13］。miR?107是一種富含于腦內(nèi)組織的miRNA，在早期AD發(fā)病進(jìn)展中在顳葉皮層灰質(zhì)區(qū)表達(dá)活性降低，鄰近大腦組織中神經(jīng)元血小板的計(jì)數(shù)和神經(jīng)元纖維纏結(jié)數(shù)的增加與miR?107的表達(dá)水平降低有關(guān)［14］。研究證實(shí)，AD病理過程重要的致病因子Aβ可通過降低miR?107的表達(dá)水平損傷血腦屏障的完整性［15］。上述結(jié)果提示miR?107可能通過影響AD的病理過程而調(diào)控其學(xué)習(xí)記憶的能力，但是具體的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

為了探討miR?107對(duì)于AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的影響，本研究通過立體定位系統(tǒng)，采用微量注射的方法通過miR?107表達(dá)病毒特異性的提高AD模型鼠海馬區(qū)miR?107的表達(dá)水平。然后通過一系列的方法檢測(cè)過表達(dá)miR?107對(duì)于AD模型鼠的影響。免疫印跡的結(jié)果提示過表達(dá)miR?107能夠顯著增加海馬區(qū)突觸相關(guān)蛋白NR2B和GluR1的水平，miRNA可以通過和目標(biāo)基因的調(diào)控區(qū)序列或者調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平而改變相關(guān)蛋白的表達(dá)。本研究中沒有獲得miR?107直接調(diào)控NR2B和GluR1表達(dá)的證據(jù)，所以推測(cè)是通過調(diào)節(jié)某種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平間接地上調(diào)了NR2B和GluR1的蛋白水平，這也將是筆者后續(xù)研究的主要內(nèi)容。NR2B和GluR1均屬于谷氨酸受體家族成員，能夠通過影響突觸傳遞和可塑性調(diào)控學(xué)習(xí)記憶［16］，所以上調(diào)的NR2B和GluR1水平可以改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［16］。水迷宮是檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的最常用實(shí)驗(yàn)方法，本研究的結(jié)果表明病毒組的AD小鼠在定位航行階段的潛伏期明顯縮短，證明該組小鼠的學(xué)習(xí)能力得到了改善，而在空間搜索階段穿越平臺(tái)位置的次數(shù)也顯著增加，說明了其空間依賴的記憶能力得到了明顯提高，具體的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。國(guó)內(nèi)外關(guān)于AD的研究大多數(shù)關(guān)注于減少能引起病理特征的β淀粉樣蛋白和Tau蛋白，本研究通過改變腦內(nèi)特定miRNA水平，提高突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終改善了AD模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力?？傊?，本研究通過特異性上調(diào)AD模型鼠海馬區(qū)的miR?107表達(dá)水平，增加了學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白NR2B和GluR1的水平，改善了AD模型鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，為AD藥物研發(fā)和臨床治療提供了新的思路。