香煙煙霧暴露誘導(dǎo)小鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制

廖思聰 王大新

1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科（長沙 410011）；2江蘇省蘇北人民醫(yī)院心內(nèi)科（江蘇揚(yáng)州 225001）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是血管組織中最主要的細(xì)胞類型，在生理狀態(tài)可維持低水平的死亡和增殖功能，然而在動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生發(fā)展過程中，VSMC的凋亡水平異常增高，提示VSMC的功能變化在AS等慢性炎癥疾病中具有重要地位［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在人AS斑塊中VSMC是泡沫細(xì)胞的主要細(xì)胞來源之一，VSMC源性泡沫細(xì)胞在AS病程進(jìn)展中，發(fā)生凋亡或壞死將可能是引起斑塊不穩(wěn)定甚至破裂的重要因素［2-3］。吸煙是心血管疾病公認(rèn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，香煙煙霧暴露可引起血管內(nèi)皮的功能障礙，并引起慢性炎癥狀態(tài)［4-5］，但因香煙煙霧中成分復(fù)雜，其致病機(jī)制目前尚無定論。AS的發(fā)生發(fā)展過程相當(dāng)復(fù)雜，AS形成機(jī)制目前尚不完全清楚，因此，研究VSMC凋亡的誘發(fā)機(jī)制可能對(duì)防治AS具有重要的理論和臨床意義［6-7］。本研究以香煙煙霧提取物體外干預(yù)小鼠VSMC為切入點(diǎn)，探討香煙煙霧暴露對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響及可能的機(jī)制，為抗AS研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Bax抗體和GRP78抗體購自美國Santa公司；Bcl?2抗體和Chop抗體購自美國CST公司；β?actin抗體購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；PVDF膜購自美國Merck公司；ECL顯影液購自美國Thermo公司。胎牛血清購自浙江天杭生物公司；紅金龍香煙為中煙工業(yè)公司產(chǎn)品；山羊抗兔二抗和小鼠二抗為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；青鏈霉素雙抗溶液、RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白定量試劑盒為北京索萊寶公司產(chǎn)品；Annexin V?FITC/PI凋亡檢測試劑盒為北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒以及PCR擴(kuò)增試劑盒均為北京天根科技公司產(chǎn)品。Tecan M2000酶標(biāo)儀為美國Tecan公司產(chǎn)品；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像儀為美國Bio?Rad公司產(chǎn)品；Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞株VSMC由南京醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系惠贈(zèng)，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。用0.25%胰酶消化傳代，只取10代以內(nèi)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，CSE低濃度組、中濃度組和高濃度組則分別加入終濃度為1%、5%和10%的CSE，細(xì)胞培養(yǎng)12 h后行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.3 香煙煙霧提取物的制備 參考LEE等［8］報(bào)道的方法制作負(fù)壓抽吸裝置，制備本實(shí)驗(yàn)所需的香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）。1支點(diǎn)燃的香煙（焦油含量10 mg/支，尼古丁含量0.9 mg/支），使用50 mL針筒通過負(fù)壓吸引裝置將香煙煙霧連續(xù)抽吸入盛有20 mL PBS的密閉燒瓶內(nèi)，持續(xù)抽吸3～5 min直至香煙燃盡。抽吸完畢后溶液經(jīng)0.22 μm孔徑濾器過濾以除去細(xì)菌和大分子顆粒，即得到濃度為100%的CSE原液。實(shí)驗(yàn)所需的不同濃度CSE溶液用相應(yīng)體積的無血清培養(yǎng)基稀釋，配制好不同濃度的CSE須在30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK?8法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，對(duì)照組細(xì)胞使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，各CSE處理組分別給予不同濃度CSE（1%、5%和10%）的無血清培養(yǎng)基處理，同時(shí)設(shè)不接種細(xì)胞只含培養(yǎng)基的空白組，每組3個(gè)復(fù)孔，12 h后加入10 μL CCK?8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，隨后經(jīng)酶標(biāo)儀檢測各樣本在450 nm處的OD值。細(xì)胞存活率=（OD處組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 參照凋亡試劑盒操作，消化收集細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞密度約為5×105個(gè)/mL，離心（4 ℃，1 000 r/min）5 min，預(yù)冷 PBS漂洗細(xì)胞2次，棄上清，細(xì)胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液，隨后加入5 μL Annexin V?FITC 和10 μL碘化丙碇（PI），室溫避光反應(yīng)15 min，再加入 400 μL PBS，30 min內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。Annexin V?FITC陽性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，PI陽性細(xì)胞為晚期凋亡或壞死細(xì)胞，而Annexin V?FITC/PI雙陰性細(xì)胞為正常活細(xì)胞，故Annexin V?FITC單陽性細(xì)胞群占總細(xì)胞群的百分比即為本實(shí)驗(yàn)檢測的細(xì)胞凋亡率。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA表達(dá) 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因的引物序列，由上海生工生物公司負(fù)責(zé)合成。各引物序列如下：Bcl?2正鏈5′?CCAGGACGTCTCCTCTCAGG?3′，反鏈 5′?AA?GATGGTGATGGGCTTCCCG?3′；Bax正鏈 5′?CGT?GAGCG GCTGCTTGTCTG?3′，反鏈 5′?TGGTGAGC?GAGGCGGTGAG?3′；Grp78正鏈 5′?GCGTCGGTGT?GTTCAAGAAC?3′，反鏈5′?AAGGGTCATTCCAAGT?GCGT?3′；Chop 正鏈5′?CCAACAGAGG?TCACACG?CACATC?3′，反鏈 5′?TCGTTCTCCTGCTCCTTCTCC?TTC?3′；Gapdh正鏈5′?TGGCAAAGTGGAGATTGTT?GCC?3′，反鏈 5′?AAGATGGTGATGGGCTTCCCG?3′。參照總RNA提取試劑盒的操作說明提取細(xì)胞RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，隨后加入SYBR Green試劑經(jīng)熒光定量PCR儀檢測分析，最后通過擴(kuò)增曲線、溶解曲線以及各樣本的CT值確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本的mRNA相對(duì)表達(dá)。

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá) 參照RIPA蛋白裂解液說明書提取細(xì)胞總蛋白，每孔加入200 μL含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解10 min后，4℃，12 000g離心10 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測各樣本的蛋白濃度。將蛋白樣本與5 X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min后暫存于-20℃冰箱。每孔總蛋白上樣量為30 μg，使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別用Bcl?2抗體（1∶1 000）、Bax抗體（1∶1 000）、GRP78抗體（1∶1 000）、CHOP抗體（1∶1 000）和β?actin抗體（1∶3 000）4℃孵育過夜，對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗（小鼠二抗1∶4 000，兔二抗 1∶3 000）室溫孵育1 h，PBST溶液洗膜3次后，經(jīng)ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值。本實(shí)驗(yàn)以β?actin作為內(nèi)參，各目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值則為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one?way ANOVA），組間均數(shù)比較用Dunnett法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香煙煙霧暴露抑制VSMC增殖 為檢測香煙香霧暴露對(duì)VSMC細(xì)胞增殖的影響，本研究設(shè)置1%、5%和10%不同濃度的CSE處理組，以CCK?8法檢測VSMC細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示（圖1），對(duì)照組、1%CSE處理組、5%CSE處理組和10%CSE處理組細(xì)胞存活率分別為（100±2.16）%、（97.66± 1.57）%、（91.18± 4.86）%和（85.37± 2.75）%。其中，1%CSE處理組相比對(duì)照組細(xì)胞增殖有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.17），而5%CSE處理組和10%CSE處理組細(xì)胞增殖較對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié)果提示，香煙煙霧暴露可抑制VSMC細(xì)胞增殖，同時(shí)也為后續(xù)探索細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)條件提供依據(jù)。

圖1 CSE對(duì)VSMC細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effect of CSE on the proliferation of VSMC cells

2.2 香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC細(xì)胞凋亡 為探討香煙煙霧暴露對(duì)VSMC凋亡的影響，結(jié)合此前細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究以1%、5%和10%不同濃度CSE干預(yù)細(xì)胞12 h后，通過Annexin V?FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率相比對(duì)照組（5.84±1.21）%，1%CSE處理組（14.20±1.53）%、5%CSE處理組（24.18±2.44）%和10%CSE處理組（30.64±2.52）%呈濃度依賴性顯著增高（圖2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的檢測結(jié)果顯示，1%CSE處理組、5%CSE處理組和10%CSE處理組中抗凋亡效應(yīng)的Bcl?2蛋白和mRNA水平，相比對(duì)照組表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)，而促凋亡作用Bax的蛋白和mRNA表達(dá)則濃度依賴性上調(diào)（圖3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，香煙煙霧暴露對(duì)VSMC細(xì)胞凋亡具有明顯的促進(jìn)作用。

2.3 香煙煙霧暴露激活ERS信號(hào)途徑 本研究推測香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC凋亡可能與激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑有關(guān)，因此進(jìn)一步檢測了2個(gè)ERS標(biāo)志分子GRP78以及Chop的蛋白和mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示相比對(duì)照組，1%CSE處理組、5%CSE處理組和10%CSE處理組GRP78和Chop的蛋白與mRNA表達(dá)呈濃度依賴性增加（圖4），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，香煙煙霧暴露可激活VSMC細(xì)胞的ERS信號(hào)。

圖2 CSE對(duì)VSMC細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 The effect of CSE on the apoptosis of VSMC cells

圖3 CSE對(duì)VSMC細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of CSE on the expression of apoptosis related protein and mRNA in VSMC cells

圖4 CSE激活VSMC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)Fig.4 CSE activates the endoplasmic reticulum stress signal of VSMC cells

3 討論

VSMC是血管組織中合成膠原纖維的主要細(xì)胞，可維持AS斑塊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，一旦VSMC細(xì)胞死亡將導(dǎo)致斑塊中膠原成分減少，這也是后續(xù)斑塊不穩(wěn)定甚至破裂的重要原因之一［1，9］。DICKHOUT等［10］在人體冠心病組織中證實(shí)與穩(wěn)定型斑塊相比，傾向于破裂的薄壁型斑塊以及破裂的斑塊內(nèi)凋亡細(xì)胞異常增加，包括GRP78和Chop等ERS標(biāo)志信號(hào)表達(dá)增高，并發(fā)現(xiàn)這些斑塊組織中凋亡細(xì)胞和高表達(dá)的ERS相關(guān)蛋白主要來源于VSMC。隨著AS疾病進(jìn)展，斑塊中巨噬細(xì)胞的吞噬能力會(huì)逐漸減弱，將難以吞噬清除凋亡的VSMC，一旦這些殘余的凋亡細(xì)胞發(fā)展為壞死細(xì)胞，并釋放白介素（interleukin，IL）IL?1α、IL?6和單核趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein）等炎癥因子，將導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)，加劇AS的發(fā)生發(fā)展［6，11-12］?？傊訴SMC凋亡為靶標(biāo)逐漸成為AS的研究熱點(diǎn)［13-14］，對(duì)防治心血管疾病具有重大意義。

吸煙是心血管疾病公認(rèn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是肺部疾病重要的致病因素［15］。LEE等［8］研究證實(shí)香煙暴露可促進(jìn)小鼠肺成纖維細(xì)胞合成IL?6、TNF?α以及活性氧族（reactive oxygen species）等促炎因子，引起炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激。香煙煙霧的成分復(fù)雜多變，含有多種有毒有害物質(zhì)，不僅對(duì)呼吸系統(tǒng)具有直接的細(xì)胞毒害作用，香煙中有害物質(zhì)溶于血液后可能對(duì)心血管系統(tǒng)也有長期潛在的致病作用［16］。本研究表明，CSE體外干預(yù)VSMC后細(xì)胞凋亡率明顯增加，而Bcl?2的蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)，Bax的蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)，推測香煙煙霧暴露可誘導(dǎo)VSMC凋亡。凋亡是在各種生理或病理狀態(tài)下細(xì)胞的一種程序性死亡方式，凋亡過程受到促凋亡和抗凋亡的雙重調(diào)控，其中BCL?2家族在平衡凋亡過程中具有重要作用?；诮Y(jié)構(gòu)和序列的同源性，BCL?2家族中抗凋亡蛋白包括 Bcl?2、Bcl?xl以及 MCL?1 等，而 Bax、Bak 和Bim等蛋白則具有促凋亡效應(yīng)［17］。例如，Bax可介導(dǎo)細(xì)胞色素C（cytochrome C）自線粒體釋放至胞質(zhì)中，進(jìn)而通過經(jīng)典的線粒體途徑促發(fā)細(xì)胞凋亡［18］。

ERS是在各種原因激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）后細(xì)胞做出的適應(yīng)性反應(yīng)，在AS中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［19］。早期輕度的ERS通過誘導(dǎo)糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose regulated pro?tein 78 kD，GRP78）等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶表達(dá)增加，以減輕UPR從而產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，而持續(xù)或強(qiáng)烈的ERS可通過Chop、caspase?12以及JNK等信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chop蛋白作為ERS信號(hào)分子，同時(shí)也是激活細(xì)胞色素C極其重要的誘導(dǎo)因子。細(xì)胞色素C自線粒體釋放至胞質(zhì)引起的線粒體膜電位變化，可直接促發(fā)細(xì)胞凋亡［20-22］。因此GRP78和Chop可在一定程度反映ERS強(qiáng)烈程度，是細(xì)胞發(fā)生ERS的標(biāo)志信號(hào)。本研究結(jié)果顯示，CSE可濃度依賴性增加VSMC細(xì)胞中GRP78以及Chop的蛋白和mRNA表達(dá)，因此推測香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC凋亡可能與ERS信號(hào)途徑有關(guān)。任妮娜等［23］報(bào)道PM2.5暴露可致肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬，提示本研究中香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC凋亡部分與ERS有關(guān)外，可能也有細(xì)胞自噬的參與，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，本研究通過CSE體外干預(yù)小鼠VSMC較好地模擬吸煙可能引起的細(xì)胞損傷，首次從ERS途徑探討了香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC凋亡的分子機(jī)制。本研究的局限性在于只涉及體外實(shí)驗(yàn)，今后還需進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。綜上所述，香煙煙霧暴露可能通過ERS途徑誘導(dǎo)體外VSMC凋亡。抑制香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的VSMC凋亡可能是今后抗AS新的研究思路。